PPR蛋白是一类广泛存在于陆生植物中的RNA结合蛋白。PPR蛋白的缺失可带来生长迟缓、雄性不育、种子败育等发育缺陷,其作用机制主要是参与细胞器RNA的转录后加工过程,包括RNA前体切割、末端成熟、稳定、剪接以及编辑等。从反向遗传学出发,我们确定了目标基因PPR114,然后从玉米UniformMu库订购了ppr114的两个等位突变体,并对突变体进行了如下研究:1)鉴定插入并观察表型,确定PPR114的突变与种子突变表型的连锁关系;2)PPR114的亚细胞定位;3)筛查突变体中细胞器编码基因转录本RNA编辑存在的异常,确定PPR114的作用底物;4)比较突变体和野生型中线粒体复合物的组装和活性差异;5)结合PPR code分析推测编辑位点的顺式作用元件。通过上述分析得出以下结论:1)ppr114的突变体种子呈现出空果皮表型,胚及胚乳严重败育。小群体基因型分析和等位突变体杂交测试,确定PPR114的突变导致种子败育。PPR114/ppr114杂合植株结出的野生型籽粒和突变体籽粒出现了近3:1的表型分离。石蜡切片观察结果显示突变体的胚及胚乳发育迟缓,胚发育停滞在过渡期。2)编码一个定位于线粒体的E+亚类PPR蛋白。将PPR114蛋白序列与PPR的保守基序比对,发现PPR114属于E+亚类PPR蛋白。TargeP预测表明,PPR114为线粒体定位蛋白。构建亚细胞定位载体,初步认定PPR114为线粒体定位。3)PPR114参与nad7-769和atp4-118的RNA编辑。PLS亚家族的PPR蛋白被报道参与细胞器RNA的C→U的编辑。筛选结果表明ppr114中nad7-769和atp4-118C→U的编辑缺失,导致Nad7第257位氨基酸由半胱氨酸转变为精氨酸(C257R),同时,Atp4第40位氨基酸也由半胱氨酸转变为精氨酸(C40R)。4)PPR114的缺失影响复合物Ⅰ的组装和活性。Nad7是线粒体复合物Ⅰ的关键亚基,其功能缺失将线粒体导致细胞色素呼吸途径的电子转移受阻,进而影响线粒体功能。通过非变性活性蛋白胶(BN-PAGE)对线粒体蛋白复合物的分析发现,突变体中复合物Ⅰ的组装相较野生型严重缺失,同时NADH脱氢酶的活性严重降低。由此推测,ppr114中nad7-769编辑的缺失导致Nad7功能异常,进而影响了线粒体复合物Ⅰ的正常组装,致使NADH脱氢酶活性急剧降低。5)PPR114的缺失影响复合物V的组装。Atp4作为ATP合成酶(F0F1)侧茎的组成部分,参与维持F0F1全酶的稳定。通过硝酸铅染色法检测ATP水解酶,发现ppr114突变体中游离F1亚基较野生型明显增高;此外,使用ATPasea特异性抗体的western blotting结果也显示ppr114突变体中游离F1亚基含量明显增加,因此推测线粒体复合物V的组装受到了影响。6)nad7-769和atp4-118这两个编辑位点上游16 nt核苷酸序列很可能作为这两个编辑位点的顺式作用元件。nad7-769和atp4-118的上游16 nt核苷酸和下游3 nt核苷酸的比对结果显示有60%的一致性。同时根据PPR code推算出的P和S基序的识别核苷酸序列与编辑位上游16 nt的序列可很好对应,由此推测这两个编辑位点上游16 nt的核苷酸序列作为很可能作为nad7-769和atp4-118顺式作用元件被PPR114识别结合。综上所述,PPR114通过参与nad7-769和atp4-118的编辑,调节线粒体编码基因的表达,从而实现对种子发育的调控。