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目前已知可致人发病的正痘病毒主要有天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒及猴痘病毒。猴痘病毒1958年在实验动物中被发现,1970年首次报道感染人类,该病毒在人类中引起类似天花的病症,临床表现为发热出疹后结痂,但病情相对较轻。猴痘为人畜共患病,其首要宿主为啮齿类动物,偶见宿主为灵长类动物,人通过接触感染的动物而发病。截止到2017年5月全球共报道4437份病例,主要集中于中西非热带雨林地区,病死率为4%～10%。2003年5月,美国由于从非洲进口 了带有病毒的土拨鼠,使病毒在威斯康星与俄亥俄等5个州传播,造成数十个病例,说明该病可以跨越自然疫源区的地理界限迅速蔓延,引起各国警惕。猴痘也成为继天花灭绝以来,现存于今的正痘病毒感染相关疾病中最重要的传染病。猴痘病毒与天花病毒均被认为有潜在生物恐怖威胁的病原体,在天花被消灭后,猴痘病毒依然存在于自然界,威胁人类安全。因此,建立快速准确的猴痘病毒诊断方法,才能制定相关措施政策,控制其可能造成的危害。PCR是目前国内外主要检测方法,但需要依赖设备和敏感的样本。我国目前尚未建立除PCR检测法外的其他诊断方法。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所承担着对猴痘病毒应急反恐的任务,本研究旨在为疾控系统建立猴痘病毒特异的免疫荧光检测法,为我国应对可能出现的猴痘疫情以及生物反恐提供应急技术储备。猴痘病毒基因组由大小约为196kb的双股正链DNA组成,基因组被分为A～P 16个区段,且与其他正痘病毒基因组同源性高。A区中A29基因编码的A29蛋白是病毒的包膜蛋白,介导病毒对宿主细胞的识别作用。在痘苗病毒中与A29蛋白同源的A27蛋白及牛痘病毒中同源的162蛋白同源性为95%。国外用猴痘病毒制备的一株特异性单克隆抗体mAb 69-126-3-7的抗原表位定位于A29蛋白上一段多肽A2917～49。为建立猴痘病毒特异性免疫荧光检测方法,基于以上国外研究结果,本论文做了如下研究工作:利用A2917～49多肽作为免疫原,免疫小鼠获得脾细胞,使之与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞;用基因工程方法表达猴痘病毒A29蛋白,及与之同源的痘苗病毒A27蛋白和牛痘病毒162蛋白作为猴痘特异单抗筛选抗原系统;筛选并制备猴痘病毒特异性单克隆抗体,然后通过免疫荧光检测方法用真核细胞表达的A29、A27、162蛋白以及痘苗和鼠痘病毒分别对筛选的单克隆抗体进行特性鉴定。主要研究结果如下:1、在原核表达系统分别高效表达了猴痘病毒A29蛋白、痘苗病毒A27蛋白和牛痘病毒162蛋白,经His-Bind亲和层析柱纯化,三蛋白纯度分别为90.6%、93.8%及96.1%。获得可用于猴痘单克隆抗体筛选的抗原系统。2、经A2917～49多肽免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合率为94%,用抗原筛选系统,筛选获得8株猴痘病毒特异性单克隆抗体。其中两株为IgG3型,其余为IgG1型。选取3个高活性单克隆细胞株进行腹水法制备并纯化单抗,纯度均为90%以上。利用生物膜层干涉技术检测3株纯化抗体与A29蛋白亲和力,结果表明,3-8G4、3-8G6、3-3G9三株单抗平衡解离常数分别为KD=1.97E-09、KD=1.00E-08、KD=2.80E-09。可见,与A29蛋白结合亲和力最强的为3-3G9株单抗,以此株抗体作后为候选株,进行后续进一步的单抗特异性验证。3、在真核细胞中表达猴痘病毒A29蛋白、痘苗病毒A27蛋白和牛痘病毒162蛋白,用免疫荧光检测方法证明了猴痘单抗只与A29蛋白反应,与A27、162蛋白无交叉反应,说明候选株单抗具有好的特异性,且其线性表位在天然A27蛋白中是暴露的。4、用候选猴痘单克隆抗体通过免疫荧光法对本科室保存的痘苗与鼠痘病毒进行检测,结果表明猴痘单抗与此二种正痘病毒不发生交叉反应,进一步证明单抗的特异性良好。因此,此单抗可用于后期猴痘病毒特异性免疫荧光检测方法的研制。