研究背景现代医疗,对于实体性器官病变终末期的病人,器官移植成为挽救他们生命不可或缺的一项治疗手段。为了防止预防排斥反应造成的移植器官坏死,临床上使用新的副作用少、效力强大的免疫抑制剂如环孢素A和单克隆抗体OKT3,器官移植的疗效大为提高。但是使用免疫抑制剂的同时,同样带来了很多副反应。我们实验室试图从基因学上寻找新的方向,为延缓移植排斥提供新的靶向。NAD依赖性去乙酰化酶sirtuin 2是一种在人体中由SIRT2基因编码的酶,。这种蛋白质的研究往往是不同的,突出了SIRT2对细胞背景的多效性依赖性。与其他sirtuin家族成员相似,SIRT2显示无处不在的分布。SIRT2在许多组织和器官中表达,特别是在代谢相关组织中检测到。SIRT2主要参与DNA代谢、染色质调节和乙酰化,在多种生物代谢过程中发挥着调节作用,如细胞周期控制、基因组完整性、细胞分化、DNA修复、代谢平衡、自噬、肿瘤发生及神经退行性病变。近些年,SIRT2在先天性免疫中发挥的作用渐渐受到关注,但在移植排斥,免疫调节方面的研究却微乎其微。骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)是一个异质性群体,它们既能够抑制自然杀伤细胞和NKT细胞的细胞毒性,又能够介导T细在胞移植排斥反应的效应。研究表明多种信号传导通道负责了MDSC介导的T细胞抑制,抑制T细胞增殖,并促进T细胞凋亡。此外,MDSC分泌了细胞因子,有着诱导Treg细胞发育。在小鼠中,MDSC被广泛定义成CD11b+Gr-1+细胞。根据以上的研究背景,建立同种异体免疫移植模型,研究在SIRT2KO受体小鼠身上移植物的排斥情况,并进一步研究其免疫调节作用。第一部分Sirt KO可以有效延缓同种异体免疫排斥现象目的:1.研究同种异体移植下,SIRT2KO和C57BL/6受体小鼠对移植皮肤的排斥作用。2.验证在同种异体移植下,SIRT2KO和C57BL/6受体小鼠体内的T细胞的免疫状态。方法:建立同种异体移植模型,取Balb/c供者小鼠尾部皮肤移植到受者SIRT2KO小鼠和C57BL/6小鼠背部,每日定时拍照记录。在移植排斥较为明显的第十天,取移植皮片做H&E染色,观察实验组与对照组移植皮片在病理组织下的差异。在移植后的第7天、第9天和第10天,Bleeding取眼球血,流式方法检测实验组和对照组受体小鼠血液中CD4+和CD8+T细胞。最后在移植较为明显的第10天,取受体小鼠免疫器官引流淋巴结和脾脏,流式检测CD4+和CD8+细胞CD44 high CD62L low细胞的含量。结果:1.在同种异体移植下,随着移植天数的变化,我们在移植后第九天发现相对受体小鼠,C57BL/6对照组小鼠背部的移植皮片毛发开始脱落,皮肤干枯、组织坏死并伴有痂壳形成,在移植后第10天更为明显,对照组移植皮片开始脱落局部出现破溃。2.在移植后的第十天,我们取受体小鼠背部的移植皮肤,做H&E染色,组织切片在电子显微镜下观察,发现,对照组C57BL/6小鼠背上的供者皮片表皮层大部分消失,真皮组织和毛囊、皮脂腺大部分也缺如,皮肤组织破坏较为严重。3.在移植,为了验证SIRT2KO具有移植免疫排斥的能力,我们对受体小鼠血液中的T细胞进行检测,在移植第7天、第9天和第10天,我们发现SIRT2KO受体小鼠血液中的CD44 high CD62L low细胞相对实验组是较少的,说明SIRT2KO小鼠在移植后,处于一个免疫移植迟缓的状态,防止了免疫排斥。在移植后第10天,我们再次检测了受体小鼠免疫器官中CD44 high CD62L low细胞了,得出同样的结果,SIRT2KO后有着抑制免疫排斥的能力。结论:在同种异体移植后,SIRT2KO受体小鼠有着抑制T细胞的能力,从而延缓免疫排斥现象。第二部分在Sirt2受体小鼠中分析浸润免疫细胞类型目的:1.观察同种异体移植后,受体小鼠体内Th1和Th1细胞的变化情况。2.研究移植后受体小鼠体内CD11b+Gr1细胞的变化。3.检测移植后受体小鼠体内Treg细胞和Th17细胞的变化。方法:在建立同种异体移植模型的第10天,取受体小鼠脾脏和淋巴结细胞,用流式的方式检测代表Th1标志物IFN-γ和代表Th2标志物IL-4。随移植天数的变化,我们Bleeding取受体小鼠眼球血液,动态检测了CD11b+Dr1+细胞的变化情况,在移植排斥的第10天,我们取受体小鼠的免疫器官脾脏、淋巴结及骨髓流式检测CD11b+Dr1+细胞的变化。为了进一步探索小鼠体内T细胞的调节效应,我们用流式细胞仪检测了移植后第10天受体小鼠体内CD25+FOXP+细胞和Th17细胞的变化。结果:1.在同种异体移植的第10天,我们流式检测了Th1细胞和Th2细胞的变化。发现SIRT2KO受体小鼠体内IFN-γ是低于对照组C57BL/6受体小鼠,而IL-4是高于对照组受体小鼠,由此,我们猜想SIRT2KO后有移植T细胞的作用并且促进Th1向Th2转化的能力。2.根据有关的研究,发现代表MDSC的标志物CD11b+Gr1+细胞有着抑制T细胞的作用,我们动态检测了移植后受体小鼠血液中CD11b+Gr1+细胞,发现SIRT2KO后血液中的CD11b+Gr1+细胞明显高于对照组。进一步检测了移植后第10天脾脏、引流淋巴结和骨髓中CD11b+Gr1+细胞,得出与之前一直的结果,SIRT2KO后在同种异体移植下,有诱导CD11b+Gr1+细胞增高的能力。3.体内调节T细胞细胞不止一种,有关报答,Treg细胞也有着调节T细胞的能力,我们采用流式方式,检测了Treg细胞的分子标志物CD25+FOXP+,发现对照组和实验组无明显变化,说明Treg不是SIRT2KO调节T细胞免疫的原因,我们又检测了Th17细胞,发现对照组相对于实验组有上升趋势。结论:在同种异体移植后,SIRT2KO有着抑制T细胞免疫,促进Th1向Th2细胞转化的功能,这种调节作用可能与CD11b+Gr1+细胞的增多有关,而与Treg无关。第三部分SIRT2KO诱导的CD11b+GR1+细胞募集延缓同种异体移植目的:1.研究SIRT2KO后诱导CD11b+Gr1+细胞增多的原因。2.CD11b+Gr1细胞的功能。3.剔除CD11b+Gr1+细胞后SIRT2KO的免疫效应。方法:1.在移植第10天,去受体小鼠脾脏细胞,制成单细胞悬液,进行细胞表面染色,在流式细胞仪上检测对照组和实验组受体小鼠CD11b+Gr1+细胞的凋亡情况。在移植第8天给受体小鼠注射Brd U,在48小时后流式检测小鼠脾脏CD11b+Gr1+细胞的增值情况。CXCL2趋化因子作为粒细胞迁移的标志物,我们在移植后第10天,受体小鼠脾脏、血液、引流淋巴结及骨髓中CD11b+Gr1+细胞的趋化能力。为了确定CD11b+Gr1+具有与MDSC相同的能力,我们专门用流式检测受体小鼠血液、骨髓和脾脏CD11b+Gr1+细胞分泌细胞因子TNF-α的含量。为了进一步确定CD11b+Gr1+是引起SIRT2KO延长移植排斥的原因,我们使用Anti-Gr1剔除,受体小鼠Gr1+细胞对免疫的影响,随着移植天数变化,观察移植皮片的存错情况,拍照记录。结果:1.我们研究了对照组和实验组中受体小鼠脾脏中CD11b+Dr1细胞的凋亡情况,发现SIRT2KO相对对照组未能明显改变CD11b+Dr1细胞死亡。2.我们对对照组和实验组受体小鼠注射Brd U,在48小时后,也正是移植排斥较为明显的第10天,检测受体小鼠脾脏中CD11b+Gr1+增殖情况,发现两者无明显区别。3.我们研究化学引诱物趋化因子及其受体的表达。CXCL2是粒细胞趋化因子,我们检测CD11b+Gr1+细胞在同种异体移植后的募集能力,发现SIRT2KO可以显著调节CXCL2的表达,由此,我们得出移植后SIRT2KO诱导CD11b+Gr1+细胞的募集是其细胞数量增多的原因之一。4.以前研究表明从脾脏分离的CD11b+Gr1+细胞有抑制T细胞的能力,我们检测了SIRT2KO诱导的CD11b+Gr1+细胞分泌较低TNF-α,发现其有着MDSC的特性。5.为了进一步验证同种异体移植SIRT2KO诱导的CD11b+Gr1+细胞和MDSC一样,有着抑制T细胞的能力,从而延长免疫排斥,我们选择Gr1抗体注射给SIRT2KO受体小鼠,观察移植后移植皮片的存活情况,发现SIRT2KO受体小鼠体内缺失Gr1+细胞后,在同种异体移植后,这种诱导免疫耐受的能力丧失。结论:同种异体移植后,SIRT2KO诱导的CD11b+Gr1+细胞增多,是由于其迁移能力增强导致的,而且CD11b+Gr1+细胞有着与MDSC相同的能力,及分泌较低细胞因子TNF-α,最后在受体小鼠剔除Gr1+细胞后,SIRT2KO延长移植排斥的能力也消失。