核酸中脱氧尿嘧啶和N1-甲基腺苷的检测

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在核酸当中已经有大量的修饰碱基被发现了,它们与常规的碱基(A,T/U,C,G)一起协同参与生物体的功能调控。其中有很多修饰碱基的功能化研究已经非常成熟了,例如DNA和RNA的甲基化修饰。除此以外,还有很多的修饰碱基它们的功能还处于探索发掘阶段,例如DNA中的脱氧尿嘧啶(d U)修饰,RNA中的N1-甲基腺苷(m~1A)修饰。在本论文中,我们主要以d U和m~1A作为研究对象,为探究他们在生物体内的功能以及动态变化过程提供一种简单,快捷的检测方法。DNA中的d U主要来自于胞嘧啶脱氨基作用或者d UMP的错误掺入,目前报道的有四种酶参与它的碱基切除修复即UNG,SMUG1,TDG和MBD4。基因组中d U的存在与很多的生命活动息息相关,在抗体成熟,病毒生命周期和果蝇发育的多种系统中都起着重要作用。在这里,我们报告了一种结合UNG酶切除的方法用于基因组DNA中d U的定性和定量分析。首先通过UNG酶将基因组DNA中的d U选择性地转化为AP位点,然后用化合物NRNO标记。在标记后,NRNO中的邻苯二胺转化为苯并咪唑,PET效应消失,产物在650 nm的远红外区域有强烈的发射,根据荧光强度的变化即可实现d U的定性定量检测。由于位阻效应,它可以导致聚合酶延伸停留在d U位点提供d U位点的详细信息。此外,该探针还可通过双光子共聚焦荧光显微镜进行d U含量变化的荧光成像分析。在RNA中,m~1A是发现的除m~6A以外的第二个可逆化修饰。t RNA中的m~1A修饰在t RNA结构及其稳定性上有非常重要的作用,m RNA的5’帽和5’UTR的m~1A则可能在促进翻译中发挥着重要作用。基于它的重要作用,我们开发了一种基于CRISPR-Cas13a的检测系统用于RNA中m~1A检测。当目标RNA序列中存在m~1A时会影响它与cr RNA碱基互补配对,因而不能激活Cas-13a蛋白的RNA酶活性剪切短荧光猝灭的报告RNA释放荧光信号。对于该位点为正常的A时,则可以激活RNA酶活性释放荧光信号。因此,我们可以通过荧光信号强度的变化分析对RNA中m~1A修饰进行定性定量分析。此外,在有去甲基化酶Alk B的协助下可以实现28s r RNA中1309位点处的m~1A检测。最后通过调控Alk B的去甲基化时间,该方法可以实现m~1A的动态去甲基化过程研究。
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