论文部分内容阅读
研究背景及目的白血病是骨髓造血干细胞或早期祖细胞突变引起的一种恶性克隆性造血系统肿瘤,在儿童及35岁以下成人的恶性肿瘤中,白血病的死亡率居第一位,严重威胁人类健康。急性T淋巴细胞性白血病（T-lineage acute lymphocytic leukemia,T-ALL）以大量未成熟淋巴母细胞侵犯骨髓为特征,发病率分别占儿童和成人急性淋巴细胞性白血病的10～15%和25%。T-ALL的侵袭浸润是患者死亡的常见原因和治疗难点,因此,深入探究T-ALL侵袭浸润的分子机制,寻找治疗的新靶点具有重要意义。本实验室前期研究发现趋化因子受体9（CC chemokine receptor 9,CCR9）在T-ALL白血病细胞中高表达,与T-ALL的侵袭浸润密切相关,但CCR9表达调控机制尚不明确。LncRNA主要从表观遗传、转录和转录后三个水平参与基因表达调控,本研究利用GEO数据库中20个T-ALL相关基因芯片,通过生物信息学的方法筛选出与CCR9表达呈正相关的LncRNA,并通过实验验证其对CCR9的表达调控及对T-ALL侵袭浸润的影响。活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell,NFAT）与多种转录因子联合作用调控基因的表达,参与了正常T细胞的发育及多种肿瘤的形成过程,有研究发现NFATC2在CD4+T细胞上调控CCR9的表达,而有关LncRNA、NFATC2与CCR9在T-ALL中的研究尚未见报道。本研究探讨了LncRNA TCONS＿00015691/NFATC2/CCR9轴在促进T-ALL侵袭浸润中的作用及分子机制,拟为T-ALL的诊治提供一种新思路。研究内容及方法1、探究LncRNA TCONS＿00015691调控CCR9表达,参与T-ALL侵袭浸润的作用及机制。利用生物信息学寻找在T-ALL中与CCR9表达呈正相关的LncRNA,Real-time PCR和Western Blot检测LncRNA与CCR9的表达水平,筛选出与CCR9呈正相关的LncRNA TCONS＿00015691。慢病毒技术构建LncRNA稳定敲低和回转细胞株,利用Transwell和Matrigel-Transwell实验检测天然高表达CCR9的T-ALL细胞株MOLT-4细胞的迁移侵袭能力的变化,动物实验验证LncRNA TCONS＿00015691在T-ALL浸润中的作用。2、探究NFATC2调控CCR9表达,参与T-ALL侵袭浸润的作用及机制在MOLT-4细胞中敲低NFATC1/C2/C3的表达后,Real-time PCR和Western Blot检测NFATC1/C2/C3和CCR9的表达水平,发现NFATC2可以促进CCR9的表达。构建NFATC2的稳定敲低和回转细胞株,Transwell和Matrigel-Transwell实验检测MOLT-4细胞的迁移侵袭能力的变化,动物实验验证NFATC2在T-ALL浸润中的作用。3、探究LncRNA TCONS＿00015691/NFATC2/CCR9轴促进T-ALL侵袭浸润的机制在MOLT-4细胞上敲低LncRNA TCONS＿00015691后过表达NFATC2,Real-time PCR和Western Blot检测CCR9的表达水平的变化,Transwell和Matrigel-Transwell实验检测MOLT-4细胞的迁移侵袭能力的变化,动物实验验证LncRNA TCONS＿00015691/NFATC2/CCR9轴在T-ALL浸润中的作用。研究结果1、生物信息学筛选出三条LncRNA与CCR9呈正相关,分别是LncRNA TCONS＿00024295、LncRNA TCONS＿00020560和LncRNA TCONS＿00015691,Real-time PCR和Western Blot检测发现LncRNA TCONS＿00015691敲低后CCR9的表达水平下调,回转实验发现可恢复CCR9的表达;Transwell和Matrigel-Transwell检测出敲低LncRNA TCONS＿00015691后,MOLT-4细胞迁移侵袭能力降低,回转LncRNA TCONS＿00015691后,MOLT-4细胞迁移侵袭能力得到明显回升。裸鼠体内实验结果表明,LncRNA TCONS＿00015691稳定敲低的MOLT-4细胞与对照组细胞相比,小鼠脏器中MOLT-4细胞浸润水平降低;回转LncRNA TCONS＿00015691组的小鼠脏器中MOLT-4细胞浸润水平出现明显回升。2、在MOLT-4细胞中敲低NFATC2后CCR9表达下调。Transwell和Matrigel-Transwell实验发现敲低NFATC2后,MOLT-4细胞迁移侵袭能力下降,回转NFATC2后,MOLT-4细胞迁移侵袭能力得到回升。裸鼠体内实验表明,NFATC2稳定敲低的MOLT-4细胞与对照组细胞相比,小鼠脏器中MOLT-4细胞浸润水平降低;回转NFATC2组的小鼠脏器中MOLT-4细胞浸润水平出现明显回升。3、MOLT-4细胞中LncRNA TCONS＿00015691敲低后,NFATC2和CCR9表达水平均下调,在LncRNA TCONS＿00015691敲低株上过表达NFATC2后,CCR9表达水平恢复。动物实验发现,LncRNA TCONS＿00015691敲低株上过表达NFATC2后,相较于LncRNA TCONS＿00015691敲低组,该组小鼠脏器中MOLT-4细胞浸润水平显著上调,结果提示,LncRNA TCONS＿00015691通过上调NFATC2的表达促进CCR9的表达,进而介导MOLT-4细胞在小鼠脏器中的浸润。结论:1.LncRNA TCONS＿00015691上调CCR9的表达,促进MOLT-4细胞的侵袭浸润;2.NFATC2上调CCR9的表达,进而促进MOLT-4细胞的侵袭浸润;3.LncRNA TCONS＿00015691/NFATC2/CCR9轴在T-ALL侵袭浸润中发挥重要作用。