基于滚环扩增的microRNA超灵敏检测及siRNA转染的新方法研究

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癌症是目前公认的世界范围内的健康难题,如何实现癌症的早期诊断和治疗是现如今厄待解决的问题。RNA干扰(RNAi)能够影响基因功能和表达,RNAi的发现使得很多不可成药基因的靶向和疑难杂症的治疗成为可能,并且对于癌症的个性化生物标记物诊断和基因治疗方面都有重要的意义。本论文中,我们主要以RNAi作为研究对象,围绕RNAi中microRNA(miRNA)的表达水平和siRNA的细胞内传递展开,建立一种超灵敏的血清中循环miRNA检测的生物芯片,有望用于癌症的早期诊断,同时我们还建立了高效且低毒性的siRNA细胞内传递体系,有望实现癌症治疗。miRNA通常是19-23个碱基的单链RNA,它被证实广泛参与早期发育、细胞分化、增殖、凋亡等一系列生物学过程中,并且miRNA的异常表达与人类疾病、遗传疾病和免疫系统功能改变息息相关。近期的报导表明miRNA有望成为癌症诊断和预后以及分类、分期、进展和治疗反应的生物标记物。尤其是血清中miRNA的表达谱的检测对于疾病的早期诊断具有重要的意义。我们设计了一种光子晶体辅助滚环扩增的生物诊断器件(PCs-RCA)用于血清中miRNA的检测。我们测定了此生物诊断芯片的荧光增强效应,该生物诊断器件能够实现miRNA的超灵敏检测,检出限低至0.7 a M。该芯片在高灵敏度的同时还具有良好的特异性,可以区分miRNA的单碱基差异,能够对临床血清样本中的miRNA进行准确的定量测定。同时,该芯片能够有效区分非小细胞肺癌(NSCLC)病人血清和健康人血清。此PCs-RCA生物器件可以高灵敏度、高选择性的检测生物活性分子,因此在临床疾病诊断和健康评估中具有重要意义。通过siRNA转染的基因沉默技术为表征基因功能和治疗各种疾病开辟了新的路径。然而由于siRNA分子量大、带负电荷、易被RNase降解、易肾清除性、缺乏生物靶向性等特点,决定siRNA治疗离不开运载工具的协助。鉴于传统的运载工具的高毒性、siRNA传递效率低等特点,我们设计了并合成了基于滚环扩增的DNA纳米材料,并将其应用于siRNA的转染。成功合成DNA纳米材料后我们验证了该方法对于基因沉默的效率,使用激光共聚焦和流式细胞分析方法,我们发现该方法具有与商品化试剂lipofectamine 2000相同的基因沉默效率。进一步的细胞毒性实验证明基于DNA纳米材料的转染试剂具有低毒性,即使在转染高浓度siRNA的条件下依然能够有较大的细胞存活率,这也与DNA纳米材料具有高的生物相容性这一特性相符。此转染试剂在高的转染效率的同时具有低毒性,因此我们预计这一策略将为siRNA传递系统提供一个有前景的平台,并有可能促进siRNA治疗的临床应用。
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