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异常糖基化在肿瘤的早期诊断及早期筛查中已被证明发挥重要作用,本课题组前期采用凝集素印迹（Lectin-blot）、凝集素芯片（Lectin microarray）以及糖蛋白电泳等技术对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）相关的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、肝纤维化（liver fibrosis,LF）、肝硬化（liver cirrhosis,LC）、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等肝脏疾病的异常糖基化及其临床应用进行了系列研究及探索。本研究在前期N-糖组学系列研究的基础上,基于血清N-糖指纹图谱（N-glycan fingerprint,NGFP）检测技术对肝硬化/肝纤维化的诊断和原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）高危人群的鉴别、早期诊断以及预后判断等方面进一步扩大验证,全面阐述LC/LF、PLC在发生发展过程中外周血N-糖结构丰度的改变,从糖组学角度为临床决策提供科学证据。第一部分:N-糖指纹图谱检测技术的方法学性能验证及生物参考区间的建立在本课题组前期建立的N-糖指纹图谱（N-glycan fingerprint,NGFP）检测技术的基础上,按本课题组承担的2018年国家科技部传染病重大专项（2018ZX10302205-003）研究计划,根据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》等相关标准,对NGFP检测技术的精密度和干扰因素进行性能评估,并建立参考区间。精密度分析显示:除NA3Fc（Peak10）等丰度较低的N-糖结构外,NGFP所显示的13个N-糖结构的相对丰度,均重复性精密度<10%,中间精密度<15%;干扰试验结果表明:除Peak10、Peak11、Peak12等丰度较低的N-糖结构外,NGFP检测技术受胆红素、血红蛋白及乳糜等影响较小（变异系数<10%）。系统临床性能评估表明该技术具有较高的稳定性,适合临床检测应用。由于部分N-糖结构丰度在不同性别及年龄组间的差异具有统计学意义（P<0.05）,因此本研究进一步针对不同年龄组（18-30岁,30-50岁,≥50岁）及不同性别（男性,女性）分别建立参考区间,并对参考区间进行验证,验证结果显示不同性别及年龄组的13个N-糖结构相对丰度参数均90%-100%落在所建立的参考区间内。本研究所建立的参考区间具有一定的临床适用性,为该技术未来的临床转化及临床应用奠定基础。第二部分:N-糖指纹图谱在肝硬化及肝纤维化中的特征性改变及其临床意义肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝纤维化（liver fibrosis,LF）是目前肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者最常见的疾病基础之一,HCC患者LC/LF状态的存在显著影响HCC患者术后的生存率。LC的出现是CHB患者接受抗病毒治疗的依据。目前LF的诊断及病理分级只能依靠肝穿刺活检进行确诊,肝穿活检的有创性、取材的不稳定性等缺点限制了其在临床的应用。无创血清检测若能对LF做出精准的分级判断,有助于临床对肝纤维化患者进行有效的分层管理,给予及时的抗病毒治疗,从而有机会延缓患者肝纤维化的进程。本部分研究以NGFP检测技术为基础,在一个包含1539例样本的多中心研究队列中,筛选出NGA2FB（Peak2）和NA3（Peak8）两个N-糖结构,其在LC、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）及健康阴性对照（negative controls,NCs）三组中的变化呈现相反趋势并且差异最大,将log（P2/P8）作为潜在的标志物进行研究与FIB-4进行比较。在鉴别LC与non-LC时,训练组中log（P2/P8）的ROC曲线下面积（AUC）为0.888（95%CI:0.864-0.911）,优于FIB-4的诊断效能（AUC:0.802,95%CI:0.732-0.872）（P0.05）,并可依据不同的截断值对肝纤维化患者进行分级。此外,本研究发现log（P2/P8）与肝脏炎症损害分期（G stage）、Child-Pugh分级以及临床实验室指标均具有相关性。上述结果表明,N-糖标志物log（P2/P8）对LC的诊断及LF的分期均有重要价值,有助于减少患者进行有创检测的机率,辅助临床及时作出诊治。第三部分:基于N-糖指纹图谱建立Logistic回归模型用于原发性肝细胞癌早期诊断肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）由于其隐匿的临床症状,在患者确诊时多处于中晚期,此时行肝切除的患者预后往往较差,若能在早期对HCC进行诊断将极大地提高患者术后的生存率。本部分研究纳入6个中心共2961例样本进行基于N-糖指纹图谱的HCC诊断模型的构建。首先依据不同N-糖结构丰度在HCC与non-HCC两组中的差异,筛选出log（P5/P6）、log（P9/P3）、log（P5/P4）、log（P9/P7）等进行下一步研究。其对于HCC的诊断ROC曲线下面积均可达到0.700以上,但都弱于AFP。但在AFP阴性的HCC患者中,N-糖标志物[log（P5/P6）、log（P5/P4）、log（P5/P3）、log（P9/P3）、log（P9/P1）、log（P9/P2）]的曲线下面积仍可达到0.700以上,其中log（P5/P6）在AFP阴性患者中的诊断效能保持不变（Training cohort:AUC:0.748,95%CI:0.724-0.772;Validation cohort:AUC:0.747,95%CI:0.717-0.778）。进一步结合临床肝功能指标构建HCC诊断模型Pre HCC=0.054×Age-0.020×TBIL-0.106×TP+0.180×ALB+4.879×log（P5/P6）+2.129×log（P9/P3）-1.369×A/G-0.357。在训练组及验证组中,诊断模型对鉴别HCC与non-HCC患者的ROC曲线下面积均保持在0.810以上,与AFP的诊断效率相当,且在AFP阴性的患者中,诊断模型Pre HCC在训练组与验证组都同样保持了0.800以上的曲线下面积。此外,本部分研究于2007年-2011年对207位LC患者进行随访,每隔12-24周留取相应的样本并记录相关的临床信息。研究期间发现11位患者被诊断为HCC,根据巴塞罗那分期（BCLC）将其定义为极早期HCC。在诊断极早期HCC时,诊断模型同样保持了较高的诊断效率:针对HCC-48w患者,诊断模型的ROC曲线下面积为0.789（95%CI:0.628-0.950）,以约登指数最大为原则,以0.28为最佳截断值时,Pre HCC对极早期HCC的检出率为80.00%（8/10）;而AFP的ROC曲线下面积为0.599（95%CI:0.355-0.843）,同样以约登指数最大为原则,以8.75μg/L为最佳截断值时,AFP对极早期肝癌的检出率为36.36%（4/11）。针对HCC-24w患者,诊断模型的曲线下面积为0.730（95%CI:0.532-0.928）,AFP的曲线下面积为0.824（95%CI:0.645-1.000）,但Pre HCC与AFP针对HCC-24w患者,以各自约登指数对应的最佳截断值,对极早期肝癌的检出率均为72.72%（8/11）。可以看到在预测极早期HCC时,诊断模型Pre HCC同样保持着较高的检出率。以上结果提示了,在N-糖标志物基础上建立的诊断模型对HCC的早期诊断提供了重要的依据,并且在极早期HCC的诊断同样展现了较高的应用价值,为实现HCC的早期诊断提供了新方法。第四部分:基于N-糖指纹图谱及临床实验室指标对肝细胞癌血管侵犯的术前预测研究血管侵犯分为微血管侵犯（microvascular invasion,MVI）和大血管侵犯,肝癌中大血管侵犯主要发生于门脉系统中,通常称之为门脉癌栓（portal vein tumor thrombus,PVTT）。目前大量研究表明,MVI与PVTT影响着HCC患者外科手术方式,术前有效地评估患者发生MVI或PVTT的风险,有助于指导采用合理的外科治疗方式。本研究纳入本院2015年至2018年间符合纳入排除标准行肝切除治疗的患者1839例,以2016年6月为截点,961例患者进入训练组,878例患者进入验证组。在训练组中得到与血管侵犯相关的3个N-糖结构NG1A2F（Peak4）、NA3Fb（Peak9）以及NA3Fc（Peak10）的基础上,与用单因素logistic回归得到的与血管侵犯相关的实验室指标相结合,经多因素logistic回归得到血管侵犯的预测模型VI-G+=-0.015×Age+0.139×Peak9+1.041×Peak10-0.031×TP+0.158×log AFP+0.338×log PIVKA-II+0.619×AFP-L3+0.577,该诊断模型在训练组中对预测是否存在血管侵犯的ROC曲线下面积可达到0.739（95%CI:0.708-0.771）,AFP的曲线下面积仅为0.672（95%CI:0.637-0.706）。此外在鉴别M0 vs M2以及M0-M2 vs PVTT时,训练组及验证组中诊断模型的ROC曲线下面积均达到0.700以上,而与之相比,AFP曲线下面积均不足0.700。Kaplan-Meier曲线及COX回归分析均进一步证实,诊断模型VI-G+是HCC患者术后总体生存的独立危险因素。由此可见,N-糖指纹结合临床实验室指标建立血管侵犯预测模型可以较好地预测血管侵犯的发生,并且通过不同的截断值对患者血管侵犯发生风险进行分层,为患者个体化治疗提供依据。第五部分:N-糖指纹图谱在肝内胆管细胞癌中的特征性改变及其临床意义肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是仅次于HCC的原发性肝癌的第二大组织学类型,ICC进展更为迅速,且对放化疗均不敏感,导致ICC预后较差。此外,临床使用影像学方法对ICC进行诊断,存在被误诊为HCC的可能性。因此,ICC与HCC的鉴别诊断与ICC患者的早期筛查同样重要。本研究纳入本院2014年-2018年间行手术切除且经病理确诊为ICC患者244例,HCC患者270例,临床诊断为肝内胆管结石患者59例,用于分别构建ICC早期诊断模型及ICC与HCC鉴别诊断模型。差异性分析及多因素logistic回归分析结果显示NA2（Peak5）为ICC发生的独立危险因素,与临床实验室指标结合构建ICC早期诊断模型ICC-G+=-1.382×Sex+0.432×Peak5+0.082×CEA+0.005×CA199-15.635（Male=1,Female=2）。诊断模型在训练组的ROC曲线下面积可达到0.911（95%CI:0.844-0.978）,在验证组中亦可达到0.800（95%CI:0.677-0.907）,而CA19-9的曲线下面积在训练组中仅有0.690（95%CI:0.561-0.820）,在验证组中为0.884（95%CI:0.797-0.972）,可见所构建的诊断模型在预测稳定性上总体优于单用CA19-9。对于ICC与HCC的鉴别本部分研究同样构建了鉴别诊断模型IHCC-G+=0.020×AFP-0.057×CA199+2.553×Peak2+18.448×Peak10-7.190,同样在训练组及验证组保持了0.800以上的曲线下面积,均优于单用AFP以及CA19-9时的鉴别效率。以上结果提示,N-糖标志物结合临床实验室指标建立的诊断模型对ICC的早期诊断及ICC与HCC的鉴别诊断都展示了良好的诊断效能,为临床ICC的早期筛查及鉴别诊断提供了新手段。