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CAR-T细胞治疗在血液肿瘤治疗方面显示出良好的治疗效果。然而,当前的CAR-T细胞治疗属于高度个性化的治疗,用于基因修饰的T细胞均来源于患者自身,价格昂贵,制备周期长且质量难以保证,极大地限制了CAR-T细胞治疗的临床大规模应用。对健康人来源T细胞进行基因改造,制备适用于所有肿瘤患者的即用型CAR-T细胞药物,不仅大大降低了成本且保障了质量的均一性,是未来大规模应用CAR-T细胞治疗的重要方向。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除健康人来源的T细胞TCR和HLA-I类分子,以消除不同个体之间的免疫排斥反应,是制备同种异体通用型CAR-T细胞的主要策略。但要实现多个基因同时敲除,得到较高比例的TCR-HLA-I-T细胞,必须提高CRISPR/Cas9基因敲除效率。影响CRISPR/Cas9基因编辑效率的因素很多,其中递送效率尤为关键,电穿孔法具有操作简单、经济、转染效率高、低细胞毒性、重复性好和无随机插入基因组致癌的风险等优点,常用作递送CRISPR/Cas9系统。但对T细胞电穿孔具有很高的挑战性,因为T细胞很脆弱,电穿孔DNA对T细胞毒性很大,细胞活力低且转染效率不理想,是当前应用电穿孔对T细胞进行基因编辑的主要难点。优化电穿孔T细胞条件,解决T细胞基因编辑效率不高的问题,制备同种异体通用型CAR-T细胞,对实现CAR-T细胞治疗临床大规模应用具有重要意义。目的本研究拟利用T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat为模式细胞,建立质粒电穿孔优化体系,并利用此优化系统将CRISPR/Cas9系统导入Jurkat细胞,实现对Jurkat细胞的高效基因编辑;进一步在人脐带血来源T细胞上验证该优化体系,将CRISPR/Cas9系统成功高效导入人脐带血T细胞,实现对人脐带血T细胞TCR和HLA-I类分子敲除,进一步制备同种异体通用型CD19.CAR-T细胞,体外验证所制备的通用型CD19.CAR-T细胞并未丧失特异性杀伤CD19+肿瘤细胞的能力。方法第一部分:以人T淋巴瘤细胞株Jurkat为模式细胞建立质粒电穿孔优化体系利用携带绿色荧光蛋白标记基因的质粒和Jurkat细胞,通过系统考察电穿孔的电压、脉冲时间、电转缓冲液、质粒浓度和电转后静置时间对转染效率和细胞存活率的影响,建立质粒电穿孔Jurkat细胞的优化体系。第二部分:在质粒电穿孔优化体系基础上,建立附着体CRISPR质粒电穿孔Jurkat细胞的优化体系1.检测不同附着体CRISPR质粒浓度下,电穿孔Jurkat细胞所获得的转染效率和存活率,确定电穿孔系统中的最佳附着体CRISPR质粒浓度。2.检测不同嘌呤霉素的筛选浓度下Jurkat细胞培养5天的细胞存活率,确定阴性Jurkat细胞完全死亡的最低浓度为筛选抗性基因稳定转染的最佳浓度。3.利用电穿孔优化体系,将靶向β2M基因的附着体CRISPR质粒电穿孔导入Jurkat细胞,并结合最优嘌呤霉素抗性筛选,获得HLA-I类分子完全敲除的Jurkat细胞系。第三部分:在质粒电穿孔优化体系基础上,建立RNP电穿孔人脐带血来源T细胞的优化体系1.利用RNP(Cas9蛋白与sg RNA混合物)电穿孔人脐带血来源T细胞敲除TCR分子为模型,在电穿孔优化体系基础上,探索anti-CD3/CD28磁珠/细胞比的刺激条件及电穿孔次数对其敲除效率的影响,建立RNP基因编辑人脐带血来源T细胞的最佳体系。2.在RNP基因编辑优化体系基础上进一步同时敲除TCR和HLA-I类分子,获得TCR-HLA-I-T细胞。3.采用anti-CD3/CD28磁珠刺激CFSE标记的TCR-T细胞和正常T细胞,观察T细胞的增殖情况;4.将CFSE标记的异体PBMC细胞分别与辐照的HLA-I-T细胞和辐照T细胞混合培养,观察异体PBMC中T细胞的增殖情况。5.进一步在TCR-HLA-I-T细胞基础上,制备同种异体通用型CD19.CAR-T细胞;通过杀伤实验证实所获得的通用型CD19.CAR-T具有特异性杀伤作用;ELISA检测细胞因子IL-2和INF-γ分泌情况。结果第一部分:以人T淋巴瘤细胞株Jurkat为模式细胞建立质粒电穿孔优化体系质粒电穿孔人淋巴瘤细胞株Jurkat的优化体系为:电压450V、脉冲时间20ms、电转缓冲液Opti-MEM、电穿孔后静置45min。在此优化体系下,细胞电转效率最高可达到84.3%,细胞存活率为52.2%。第二部分:在质粒电穿孔优化体系基础上,建立附着体CRISPR质粒电穿孔Jurkat细胞优化体系1.附着体CRISPR质粒电穿孔Jurkat细胞的最佳浓度是0.4μg/μl,电转效率为33%,细胞存活率为21%。2.嘌呤霉素筛选Jurkat细胞的最佳浓度为0.25μg/ml,连续筛选5天能将阴性Jurkat细胞全部杀死。3.利用附着体CRISPR质粒电穿孔优化体系获得HLA-I-Jurkat细胞,在最佳嘌呤霉素筛选浓度下,HLA-I-Jurkat细胞比例由第2天的62.23%逐渐提高至第9天的96.84%。第三部分:在质粒电穿孔优化体系基础上,建立RNP电穿孔人脐带血来源T细胞的优化体系1.电穿孔后随即加入anti-CD3/CD28磁珠能显著提高TCR分子的敲除效率,基因敲除效率由28%提升到54.9%。但1:1、2:1、3:1磁珠/细胞比之间无显著差异。多次电穿孔也可提高TCR分子的敲除效率,但随着电穿孔次数增多细胞死亡率也提高。最适电穿孔次数为3次,TCR的敲除效率可由1次电穿孔53%提升至75%,同时细胞存活率保持在80%。2.同时敲除TCR和HLA-I类分子,TCR-HLA-I-T细胞的比例可达28.9%,经过磁珠分选后可得到96.5%纯度的TCR-HLA-I-T细胞。3.Anti-CD3/CD28磁珠能刺激正常T细胞增殖,但不能刺激TCR-T细胞增殖。4.与辐照T细胞混合的异体PBMC中T细胞观察到增殖现象,但与辐照HLA-I-T细胞混合的PBMC中T细胞无增殖现象。5.慢病毒感染TCR-HLA-I-T细胞,50.2%的T细胞成功表达CAR分子。杀伤实验证实所制备的TCR-HLA-I-CD19.CAR-T对CD19+肿瘤靶细胞具有特异性杀伤效应。ELISA结果显示TCR-HLA-I-CD19.CAR-T与靶细胞接触后可分泌高浓度IL-2和INF-γ。结论1.首先以人T淋巴瘤细胞株Jurkat为模式细胞建立了质粒电穿孔优化体系。该优化体系不仅适用于高效递送附着体CRISPR质粒进入Jurkat细胞,同样也适用于高效递送RNP进入T细胞,运用此优化系统可实现对T细胞的高效基因编辑;2.在质粒电穿孔优化体系基础上,进一步建立了附着体CRISPR质粒电穿孔Jurkat细胞优化体系,可获得96.84%的HLA-I-Jurkat细胞。3.在质粒电穿孔优化体系基础上,建立了RNP电穿孔人脐带血来源T细胞的优化体系,实现同时双敲TCR和HLA-I类分子,获得无免疫排斥反应的同种异体通用型TCR-HLA-I-T细胞。通过TCR-HLA-I-CD19.CAR-T特异性杀伤和细胞因子检测实验证实所建立的RNP电穿孔人脐带血来源T细胞优化体系可应用于未来通用型CAR-T细胞治疗。