论文部分内容阅读
第一部分靶向敲除内耳支持细胞Gjb2基因小鼠模型的构建及内耳感觉上皮细胞损伤模式的观察目的:构建多种特异性内耳支持细胞Gjb2基因敲除小鼠模型探索上述模型小鼠听功能变化和毛细胞损伤模式。方法:运用Cx26flox/flox小鼠分别与Lgr5-Cre ER、Fgfr3-Cre ER小鼠杂交获得Cx26flox/flox;Lgr5-Cre ER、Cx26flox/flox;Fgfr3-Cre ER小鼠。在小鼠出生后连续两天(P0、P1)颈背部皮下注射他莫昔芬(TMX)构建特异性敲除内耳支持细胞Connexin26(Cx26)小鼠模型。基因分型鉴定Cx26flox/flox;Lgr5-Cre ER、Cx26flox/flox;Fgfr3-Cre ER小鼠作为实验组,同窝Cx26flox/flox小鼠作为对照组。耳蜗冰冻切片、基底膜铺片免疫荧光染色检测耳蜗Cx26敲除情况;采用免疫荧光染色检测小鼠耳蜗发育早期不同时间点不同内耳支持细胞中Cx26的空间分布特征。造模后18天(postnatal day 18,P18)听觉脑干电位(ABR)评估敲除组小鼠听力;基底膜铺片免疫荧光染色计数毛细胞和支持细胞缺失情况;树脂切片甲苯胺蓝染色观察Corti器形态;冰冻切片HE染色计数螺旋神经节细胞(SGN);扫描电镜联合透射电镜观察Corti器的空间结构和超微结构。结果:在正常小鼠出生后第三天(P3),Deiter’s细胞(Deiter’s cell,DC)中,Cx26优先表达于同一排相邻的DC之间,不同排的DC之间几乎没有Cx26的表达。在P5时,这种同一排DC之间的纵向Cx26的表达仍然占优势。在P7时,Cx26在DC上变为均匀的分布。成功构建敲除基底膜Lgr5、Fgfr3阳性细胞Cx26的Cx26flox/flox;Lgr5-Cre ER、Cx26flox/flox;Fgfr3-Cre ER小鼠模型。造模后18天(P18)ABR检测Cx26flox/flox;Lgr5-Cre ER小鼠未见明显的听力损伤,基底膜铺片结果显示底回第三排外毛细胞(OHC3)死亡,对应的DC细胞仍然能存活。Cx26flox/flox;Fgfr3-Cre ER小鼠表现为高频听力损失,同时有耳蜗底回的外毛细胞大量死亡,对应的DC无明显缺失。进一步电镜观察结果提示Cx26flox/flox;Lgr5-Cre ER、Cx26flox/flox;Fgfr3-Cre ER小鼠Corti器未见明显的发育障碍及超微结构的异常。结论:在小鼠P3-P5时,纵向的同排DC之间优先建立Cx26相关缝隙连接通道。在发育早期特异性敲除内耳支持细胞Cx26会导致相对应的毛细胞死亡,进而引起听力损失。特异性敲除DC细胞Cx26不会影响柱细胞发育及Corti隧道的正常开放。第二部分巨噬细胞相关免疫反应参与靶向敲除小鼠Gjb2基因诱导的内耳感觉上皮细胞损伤目的:探索巨噬细胞相关免疫反应参与特异性敲除支持细胞Gjb2基因诱导内耳感觉上皮细胞损伤的机制。方法:运用Cx26flox/flox小鼠与Fgfr3-Cre ER小鼠杂交,获得在TMX诱导下敲除Fgfr3阳性细胞Cx26的Cx26flox/flox;Fgfr3-Cre ER小鼠。在小鼠出生后连续两天(P0、P1)颈背部皮下注射他莫昔芬(TMX)构建特异性敲除内耳支持细胞Connexin26(Cx26)小鼠模型。采用双重单核-巨噬细胞分子标记(CD45+CX3CR1)观察敲除组小鼠在不同时间点内耳不同区域巨噬细胞的数量、形态以及空间分布特征;PCR检测耳蜗多种炎症相关细胞因子的转录水平;冰冻切片HE染色计数螺旋神经节细胞(SGN);冰冻切片免疫染色检测炎症趋化因子CX3CL1的表达变化。结果:靶向支持细胞Gjb2基因敲除小鼠出现底回的外毛细胞损伤,伴有基底膜下巨噬细胞激活。主要表现为:毛细胞损伤区域巨噬细胞数量明显增多,免疫细胞体积增大呈多足状改变。在P60时,敲除组小鼠毛细胞损伤随时间推移向中回进展,相应基底膜下巨噬细胞激活范围扩大。回归分析结果显示毛细胞缺失程度和募集巨噬细胞数量呈显著相关性。PCR结果显示敲除组小鼠CX3CL1 m RNA显著上调,其余常见炎症相关细胞因子TNF-α、IL-1β、CX3CR1、CCL2、CCR2、ICAM1、TLR4 m RNA水平无明显变化。冰冻切片免疫荧光结果显示敲除组小鼠DC细胞中CX3CL1蛋白荧光信号显著升高。P60时,敲除组小鼠螺旋神经节死亡,螺旋神经节损伤区域巨噬细胞数量显著增多,且Cx3cl1的表达也增多。结论:特异性敲除支持细胞Gjb2基因小鼠模型中,感觉上皮细胞的死亡伴随基底膜下巨噬细胞的募集和激活。毛细胞及螺旋神经节损伤后,损伤区域巨噬细胞的募集和激活可能CX3CL1的表达上升相关。第三部分糖皮质激素对靶向敲除支持细胞Gjb2基因小鼠听力损失及内耳感觉细胞损伤的保护作用的研究目的:探索糖皮质激素对特异性敲除支持细胞Gjb2基因诱导的听力损失及内耳感觉细胞损伤的保护作用及机制研究。方法:构建两种不同区域敲除内耳支持细胞Cx26的小鼠模型。将实验动物分为对照组(Control)、靶向敲除组(KD)、对照+地塞米松组(C+DEX)、靶向敲除+地塞米松组(KD+DEX)。对照+地塞米松组、靶向敲除+地塞米松组小鼠在P10-P18每隔一天腹腔注射5mg/kg地塞米松,对照组、敲除组给与同样剂量的生理盐水。P18时对四组小鼠进行ABR检测以及基底膜铺片计数毛细胞。分离3-5日龄小鼠耳蜗基底膜进行培养,构建葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GO)诱导的小鼠基底膜培养损伤模型,将基底膜分为对照组(Control)、造模组(GO)、对照组+地塞米松组(C+DEX)、造模+地塞米松组(GO+DEX)。造模组给与120U/LGO处理,干预组给与10mg/L地塞米松处理,培养24h收集基底膜,免疫荧光染色毛细胞计数。结果:ABR检测结果显示,P18时期Fgfr3-Cx26KD小鼠表现为高频听力损失。基底膜铺片免疫荧光结果显示Fgfr3-Cx26KD小鼠底回外毛细胞的大量缺失。与敲除组相比,地塞米松干预组(KD+DEX)高频听力损失减轻,基底膜铺片底回毛细胞的死亡也显著减少。我们在Lgr5-Cx26KD模型中也同样观察到了地塞米松对Cx26敲除诱导的内耳感觉细胞损伤的保护作用。体外基底膜培养实验,GO处理组基底膜的顶、中和底回毛细胞显著缺失,GO+DEX组顶回毛细胞缺失显著减少。结论:靶向支持细胞Gjb2基因敲除小鼠表现为高频听力损失及底回毛细胞缺失,全身给与地塞米松可部分挽救靶向支持细胞Gjb2基因敲除小鼠的听力以及减少毛细胞的死亡。进一步提示内耳免疫反应参与了Cx26敲除诱导内耳感觉上皮细胞损伤,通过干预内耳免疫反应可以达到保护内耳感觉上皮细胞以及减缓听力损失。