论文部分内容阅读
第一部分:胰腺癌中淋巴结转移及远处转移相关的长链非编码RNA的筛选研究目的:胰腺癌是一种恶性程度高且治疗难度大的消化道肿瘤,在对其早期诊断、有效治疗、改善预后和提升患者生活质量等方面有着巨大的挑战。长链非编码RNA（lncRNA）在人类疾病尤其是癌症中起到至关重要的调控作用。本部分研究主要探讨在胰腺癌中对异常表达的lncRNA的筛选,尤其是筛选发生淋巴结和远处转移胰腺癌中的异常表达lncRNA,并寻找针对lncRNA的潜在胰腺癌诊断和治疗的靶点。实验方法:先通过TCGA数据库筛选出在胰腺癌中异常表达的lncRNA,然后根据美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）系统的第七版TNM分期标准,分别对同一大小（T2/T3）肿瘤中,发生淋巴结转移和远处转移的,与未发生转移的胰腺癌样本进行比对,富集出差异表达lncRNA,然后对上述三种不同方法富集出来的lncRNA取交集,寻找到6条差异表达的lncRNA。然后通过划痕、transwell实验和免疫荧光实验对这6条lncRNA的功能进行研究。并通过Kaplan-Meier法对6条lncRNA的生存进行分析,筛选到一条具有代表性的lncRNA进行后续的深入研究。结果:我们通过TCGA数据库中对178例胰腺癌组织和4例癌旁组织中的转录组结果分析,首先对所有异常表达的lncRNA进行富集,再通过T2N0M0与T2N1M0,T2N0M1和T2N1M1的胰腺癌样本进行比对筛选出差异表达的lncRNA 275条,以及T3N0M0与T3N1M0,T3N0M1和T3N1M1的胰腺癌样本进行比对筛选出差异表达的lncRNA 169条,将以上三种筛选模型中富集出的lncRNA取交集,聚焦到6条lncRNA,它们代表着在易发生转移的胰腺癌组织中表达异常的长链非编码RNA。然后通过生存分析,发现其中LINC00365、LINC00628、AFAP1-AS1和HNF1A-AS1的表达并不能影响患者的生存和预后,只有FAM83H-AS1和LINC00261对胰腺癌患者的生存有影响。且只有FAM83H-AS1高表达组患者总生存期缩短。通过划痕,Transwell以及免疫荧光染色微丝微管,发现FAM83H-AS1促进胰腺癌细胞发生转移的能力最强。结论:通过TCGA数据库筛选出与发生转移的胰腺癌最相关的到6条表达异常的lncRNA,通过体外功能实验我们发现FAM83H-AS1促进胰腺癌细胞发生转移的能力最强。所以选择潜在原癌基因FAM83H-AS1作为接下来深入研究的主要对象。第二部分:长链非编码RNAFAM83H-AS1在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌恶性生物学行为之间的关系研究目的:在癌症的演进过程中,恶性生物学特性的表现是各种分子从转录水平、转录后水平进行多维度调控共同作用的结果。多种信号的激活/失活使得肿瘤具有无限增殖、侵袭迁移、血管生成、免疫逃逸等维持肿瘤恶性活性的能力。LncRNA 同样是具有上述复杂生物学特性的一类分子,同时由于其在分子与分子相互作用类型上具有多样性,使得lncRNA在肿瘤的演进中扮演着至关重要的角色。本研究探讨了长链非编码RNAFAM83H-AS1与胰腺癌生物学行为之间的关系。实验方法:我们通过第一部分的筛选,找到了正向影响胰腺癌侵袭转移最显著的lncRNA FAM83H-AS1。通过实时荧光定量PCR对其在胰腺癌癌旁组织/胰腺癌组织、胰腺正常导管上皮细胞/胰腺癌细胞系的表达进行检测。通过Kaplan-Meier方法分析FAM83H-AS1的表达情况与患者生存之间的关系。通过核质分离实时荧光PCR及荧光原位杂交技术检测FAM83H-AS1在胰腺癌细胞中的表达分布情况。利用慢病毒构建FAM83H-AS1过表达和敲低的稳定转染的胰腺癌细胞系,在体内外构建增殖与侵袭转移模型,检测FAM83H-AS1与胰腺癌恶性生物学行为之间的关系。结果:实时荧光PCR检测发现相较于胰腺癌癌旁组织,胰腺癌组织中FAM83H-AS1的表达明显升高,P<0.001;相较于胰腺正常导管上皮细胞,胰腺癌细胞系中FAM83H-AS1的表达呈不同程度的升高。通过Kaplan-Meier分析,发现FAM83H-AS1高表达组患者总体生存时间更短预后更差,P<0.05。通过核质分离实时荧光PCR及荧光原位杂交技术检测,发现FAM83H-AS1主要定位在胰腺癌细胞的胞质中。在体外,通过CCK8、平板克隆、EdU实验,发现过表达FAM83H-AS1能促进胰腺癌细胞增殖,敲低FAM83H-AS1则产生相反的作用,通过Transwell、划痕实验,发现过表达FAM83H-AS1能增强胰腺癌细胞的侵袭转移能力,敲低FAM83H-AS1则产生相反的效果。在体内,通过构建免疫缺陷裸鼠的皮下成瘤模型,发现FAM83H-AS1能促进胰腺癌细胞的成瘤,通过构建免疫缺陷裸鼠鼠尾全身转移模型,发现FAM83H-AS1能促进胰腺癌细胞的全身转移。结论:FAM83H-AS1在胰腺癌中高表达,并且其异常的高表达与患者不良预后成正相关。抑制FAM83H-AS1的表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖侵袭转移等恶性生物学行为。第三部分:长链非编码RNA FAM83H-AS1调控胰腺癌增殖侵袭转移的机制的研究研究目的:LncRNA调控功能的多样性往往体现在lncRNA既能与蛋白质相互作用,同时也能与DNA/RNA相互作用。本研究通过筛选出与FAM83H-AS1相互作用的下游分子,以探究FAM83H-AS1通过下游分子启动调节信号对胰腺癌恶性生物学行为影响的机制。实验方法:通过生物信息学分析和对已经报道的FAM83H-AS1在肿瘤中的调控方式和激活通路的综述,寻找FAM83H-AS1可能潜在调控的信号通路的关键分子。然后通过蛋白免疫印迹技术（Western blot）进行验证。通过信号通路中的关键分子β-catenin来寻找联系FAM83H-AS1与通路的桥接分子FAM83H。通过放线菌酮和放线菌素D实验明确FAM83H-AS1与FAM83H的调控方式。通过免疫共沉淀技术（Co-IP）对FAM83H与β-catenin直接结合及FAM83H调节β-catenin的泛素化水平进行验证,同时对在FAM83H-AS1敲低条件下FAM83H调控β-catenin的泛素化水平进行检测。通过实时荧光定量PCR技术和蛋白免疫印迹技术,对FAM83H-AS1敲低条件下FAM83H调控经典Wnt/β-catenin通路下游效应分子表达的情况进行检测。以及通过Rescue实验,验证FAM83H-AS1、FAM83H及β-catenin三者之间的调控关系。结果:通过筛选分析,经过WB验证发现FAM83H-AS1在胰腺癌中对经典Wnt/β-catenin 信号通路中的关键分子 β-catenin 起调控作用,同时已有文献报道在骨肉瘤中FAM83H对β-catenin起调控作用,而FAM83H-AS1与FAM83H在空间位置上属于DNA反义链和正义链上的基因,存在潜在调控关系的可能。过表达/敲低FAM83H-AS1,FAM83H蛋白水平随之发生同步变化。经放线菌酮（CHX）干预后,过表达FAM83H-AS1并不能影响FAM83H蛋白的降解速率。而经放线菌素D处理后,过表达FAM83H-AS1能延缓FAM83H mRNA的降解,从而使得在蛋白水平FAM83H的表达量显著增加。通过免疫共沉淀技术（Co-IP）,发现FAM83H能与β-catenin直接结合,敲低FAM83H可以使β-catenin泛素化水平增加,过表达FAM83H-AS1使得β-catenin泛素化水平降低,然而同时敲低FAM83H,β-catenin泛素化水平随之回复性地升高。过表达FAM83H-AS1使得经典Wnt/β-catenin信号通路下游效应分子MYC、MMP2、CD44的表达增高,同时敲低FAM83H,MYC、MMP2、CD44的表达随之下降。结论:FAM83H-AS1通过稳定FAM83H的mRNA,增加FAM83H的表达水平,同时FAM83H通过与经典Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin直接相相互作用降低β-catenin的泛素化水平从而增加β-catenin的表达,促进β-catenin进入细胞核进而转录调控效应分子MYC、MMP2、CD44的表达。说明FAM83H-AS1促进胰腺癌恶性生物学行为是通过FAM83H-AS1/FAM83H/Wnt/β-catenin信号轴的激活实现的。