钾（K）是植物生长发育必需的大量营养元素之一,广泛参与植物生长发育过程中的各种生理生化过程。梨树对钾素需求量大,钾对梨果品质形成具有重要作用。梨园土壤中钾素分布不均匀,有效钾含量变动范围大（19～547mg/kg）,缺钾现象时有发生。杜梨是生产上广泛应用的砧木品种,其根系对土壤养分的高效吸收对提高接穗的养分高效利用有重要意义。HAK/KUP/KT钾转运蛋白及Shaker钾通道在K+吸收过程中起重要作用,但在缺钾下杜梨的生理响应及根系中起关键吸收作用的基因及其功能迄今未有报道。因此,鉴定并分析杜梨HAK/KUP/KT及Shaker基因家族,挖掘钾吸收关键基因,探讨杜梨根系在低钾响应中的信号转导及调控模式,可为揭示杜梨耐低钾胁迫的分子机制提供重要线索。本文采用水培方法研究杜梨幼苗在低钾（LK,0.1mMK+）和适钾（CK,3mM K+）条件下根系形态和生理响应特征;通过生物信息学鉴定梨HAK/KUP/KT和Shaker基因家族并分析其表达模式;基于转录组数据分析低钾胁迫早期（处理6 h）和后期（处理15 d）的差异表达基因,探究杜梨根系对低钾胁迫的分子响应机制,挖掘影响K+吸收的重要基因;对候选基因PbHAK12进行异源转化试验以明确其功能。主要结果如下:1.低钾胁迫降低了杜梨幼苗的生物量,随处理时间延长降低程度增大。缺钾21 d时总根长、根总表面积、总体积、根尖数均显著降低,分别比适钾下降18.1%、25.9%、14.7%和26.0%。低钾下幼苗叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和胞间二氧化碳（Ci）浓度显著下降,21 d时分别下降21.6%、23.7%和21.6%。21 d时根和地上部K+含量分别下降23.9%和18.6%。低钾胁迫改变杜梨幼苗的解剖结构,叶片上下表皮破裂、空腔增多;叶柄、茎的维管组织和髓体积缩小。低钾胁迫下,杜梨幼苗叶片MDA含量及SOD活性上升,导致膜脂过氧化程度加剧。2.利用生物信息学方法首次从梨基因组中鉴定了 21个HAK/KUP/KT基因家族成员,并根据拟南芥、水稻中HAK/KUP/KT基因的分类,将其分为5个主要的基因簇。其中,Cluster Ⅱ可进一步分为3个更小亚类,Cluster Ⅳ在梨中缺失。染色体定位和基因复制结构发现片段重复和染色体加倍是梨HAK/KUP/KT基因扩增的主要驱动力,这可能与梨进化过程中发生的全基因组复制事件有关。对比分析梨与拟南芥HAK/KUP/KT基因,发现PbHAK12-14和PbHAK17与AtHAK5同源。启动子预测结果表明梨HAK/KUP/KT基因启动子区域存在多种逆境及激素响应元件。利用qRT-PCR分析了PbHAKs在各个组织、不同时期或低钾胁迫下的表达模式,结果显示PbHAKs广泛参与了杜梨生长发育过程,但具有明显的时空表达特异性。其中,PbHAK12和PbHAK17主要在根中表达,且受低钾诱导上调最明显,但PbHAK12和PBHAK17等在果实中不表达,表明该亚族不参与果实发育过程。很多Cluster Ⅱ和Ⅲ成员在果实中表达且具有时期特异性,一般在50 DAB（幼果期）或80 DAB（果实快速生长前期）表达量较高。3.利用生物信息学方法从梨基因组中鉴定了 9个Shaker基因,并根据拟南芥、水稻中Shaker基因的分类情况,将其分为5个主要亚族,结果发现各亚族的分化起源于苔藓植物之后,且亚族V在进化过程中最保守。染色体定位和共线性分析表明,梨Shaker基因家族的扩增主要源于片段重复和染色体加倍。进化分析以及Ka/Ks比值分析表明,Shaker基因家族在物种特异性复制之后的进化过程中受到了纯化选择作用。启动子预测结果表明大部分PbShaker基因参与响应逆境及激素胁迫。利用qRT-PCR及转录组数据分析了PbShakers在杜梨幼苗不同组织及花粉管发育过程中的表达模式,发现PbAKT1.1和PbKC1.2可能参与调节低钾下根系钾素吸收,而PbAKT1.2可能在花粉发育和花粉管生长中起重要作用。4.以适钾（3 mM K+,CK）为对照,利用RNA-seq技术对杜梨根系在低钾（0.1 mM K+,LK）胁迫不同时期（6 h和15 d）的转录组进行了研究。结果表明杜梨根系对低钾早期（LK-6 h vs CK-6 h）和后期（LK-15 d vs CK-15 d）的响应机制不同。低钾早期,检测到了 1820个（1330个上调表达、490个下调表达）差异表达基因;低钾后期,检测到了 1843个（629个上调表达、1214个下调表达）差异表达基因。此外,448个基因在低钾早期和后期均差异表达。很多矿质元素运输相关基因、植物激素信号转导相关基因、蛋白激酶基因、磷酸酶基因、转录调节基因、钙信号相关基因及防御反应相关基因在低钾早期和后期的表达不同。进一步挖掘转录组数据,推测杜梨根系K+运输系统在低钾早期和低钾后期有着不同的应答和调控模式。PbHAK12迅速响应短期低钾,而PbHAK17和PbAKT1.1在长期低钾中起重要作用。我们推测RCI3（Pbr034488.2）-RAP2.11（Pbr007699.1）-HAK5（PbHAK17）、SYP121（Pbr035718.1/Pbr035727.1）-KCl（PbKC1.2）-AKT1（PbAKT1）及CBL-CIPK23（Pbr042907.1）-AKT1（PbAKT1）等调控网络主要在长期缺钾时起作用,因为相关基因表达量的变化被发现于低钾后期。这些结果表明,多年生木本植物杜梨已进化出复杂的调控机制以适应低钾胁迫,尤其是长期低钾胁迫。5.根据基因表达和转录组测序结果,筛选到目标基因PbHAK12并利用异源表达体系进行功能验证。构建酵母表达载体pYES2-PbHAK12,将其转入K+吸收缺陷型酵母突变体菌株R5421,发现PbHAK12具有回补酵母突变体的能力。利用拟南芥原生质体瞬时转化系统对PbHAK12进行亚细胞定位,结果显示PbHAK12定位于细胞质膜。将PbHAK12导入Micro-Tom番茄,获得13株T0代阳性苗,其中植株Z1、Z6和Z12的叶片K+含量、净光合速率和叶绿素均高于野生型。综上所述,低钾胁迫抑制杜梨砧木幼苗生长,导致根系构型改变。在梨基因组中存在21个HAK/KUP/KT钾转运蛋白和9个Shaker钾通道基因,基因表达模式表明这些基因参与杜梨根系低钾胁迫响应。RNA-seq结果表明PbHAK12、PbHAK17和PbAKT1.1在低钾胁迫下的杜梨根系K+吸收中起重要作用。其中PbHAK12定位于细胞膜且在酵母中表现为高亲和转运体,可能参与杜梨在低钾时对K+的吸收。