双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）介导的基因沉默技术已经作为反向遗传学研究工具广泛地应用于昆虫学研究中,而且是一种非常有前景的技术,应该可以广泛用于作物保护中的害虫防治。RNA干扰（RNAi）的实现需要靶标细胞将dsRNA吸收后通过Dicer酶加工成小干扰RNA（siRNA）,siRNA再与Argonaute等蛋白形成RNA诱导沉默复合体（RISC）,通过siRNA的识别引导使RISC进一步结合到互补的mRNA上,Argonaute再将结合的靶标mRNA剪切降解掉,使其表达量降低。不同昆虫中广泛存在着能够引发RNAi反应的核心机制。然而,不同昆虫间系统性RNAi效率却差异巨大,严重阻碍了 RNAi在昆虫学中的应用。其关键问题是dsRNA分子在到达靶标位点前能否避免被核酸酶降解,保持长时间的稳定性,从而引发持续性的RNAi效应。目前研究表明,一些昆虫中肠中特异性表达的dsRNases对dsRNA具有超强的降解能力,在不同昆虫体内对RNAi效率具有负面作用。因此,本研究针对应用RNAi进行害虫防治涉及到的dsRNA稳定性这一关键问题进行探索性研究,以揭示不同昆虫对dsRNA的降解特性及其差异,从生化和分子生物学方面全面解析引起dsRNA降解活力差异的机制,并利用dsRNA降解酶的特性,进行精准的dsRNA降解活力消减实验,提升基因沉默效率。现将研究结果总结如下:1 dsRNA降解酶活力的荧光检测技术为了便于深入研究dsRNA降解酶,本研究参照Dicer酶活力测定方法,通过筛选适宜的荧光基团,建立了 dsRNA降解酶活力的荧光检测方法,并与已有的凝胶电泳法和定量PCR检测法进行了对比。结果发现以5-FAM激发光团和3-BHQ1淬灭光团组合标记的dsRNA是较理想的测试底物,反应液中0.5 μM的荧光标记dsRNA与粗酶液温育25分钟后荧光持续上升达到最大饱和值,比初始强度增加6倍,显示出适宜的反应速度和产物生成量。用该荧光标记底物设计的荧光检测法,和凝胶电永法一样可以检测不同酶源的活力状况,虽然结果不完全一致,但得到的趋势和结论相同。用所建荧光法和已有的定量PCR检测法同时检测系列稀释酶液的活力变化,所得曲线的相关系数为0.976,达到极显著水平。讨论认为,由5-FAM/3-BHQ1荧光组合标记的dsRNA底物可以用于检测dsRNA降解酶活力,以此为底物建立的dsRNA降解酶活力的荧光检测法,检测结果可靠,比凝胶电泳法精确,可定量,比定量PCR检测法操作简便,省时省物。该方法可以替代现行方法进行dsRNA降解酶活力的高通量定量测定。2 不同昆虫dsRNA降解酶的生化特性解析由于不同昆虫对RNAi敏感性具有一定的差异,而有报道表明不同昆虫体内dsRNA的降解差异与其RNAi的敏感性差异具有一定的相关性,因此对不同昆虫dsRNA降解酶进行深入研究具有重大意义。本研究利用荧光法通过测定对RNAi敏感性具有差异的不同昆虫在不同反应条件下的dsRNA降解酶活力,解析了来自于不同目昆虫的dsRNA降解酶生化特性及其活力的分布和调控。结果表明,不同的昆虫dsRNA降解酶的生化特性存在一定的共性和差异,它们均需要在碱性环境下才能发挥最大的活力。适当浓度的Mg2+能增强大多数昆虫dsRNA降解酶活力,而赤拟谷盗和果蝇dsRNA降解酶活力在Mg2+存在下却受到抑制。鳞翅目昆虫斜纹夜蛾和二化螟、直翅目昆虫东亚飞蝗和蜚蠊目昆虫美洲大蠊的dsRNA降解酶对高温的耐受性较好,47℃仍能保持较高活力,而鞘翅目昆虫大麦虫和赤拟谷盗对高温的耐受性较差,超过37℃,其酶活力急剧下降。不同昆虫dsRNA降解酶的动力学参数也存在差异,其dsRNA降解酶通常以较高的亲和力（较小的Km值）来平衡较小的Vmax值,以保持合适的降解能力。不同昆虫在不同组织间的dsRNA降解酶活力也不是均匀分布的,所测昆虫中都是中肠dsRNA降解酶活力远远高于其他组织。通过检测生理环境发现,不同昆虫的中肠液和血淋巴液pH和Mg2+浓度均不是dsRNA降解酶的最适反应环境,导致dsRNA降解酶活力在生理环境中受到了极大地限制,东亚飞蝗中肠液的酶活力在生理条件下下降了 378.2倍之多。比较不同组织酶活力与试虫对RNAi的敏感性发现,不同昆虫血淋巴酶活力与其注射RNAi反应较一致,中肠液酶活力则与喂食RNAi更接近。讨论认为昆虫体内生理环境具有调节dsRNA降解酶活力的功能,不同组织中最先接触dsRNA的组织的酶活力比整体更能反映RNAi敏感性。斜纹夜蛾幼虫体内dsRNA的快速降解及其对喂食RNAi的极度不敏感,不仅仅是由于dsRNA降解酶的大量表达,其中肠的高pH碱性环境也是重要原因之一。3 不同昆虫非专一性核酸酶基因的克隆和表达分析非专一性核酸酶家族是生物体内代谢外源核酸的主要酶类,在昆虫中已经报道了dsRNase和Endonuclease G两个基因亚家族。为深入研究不同昆虫对外源dsRNA的降解能力,本研究选取RNAi敏感性具有差异的不同昆虫,以dsRNase和Endonuclease G序列特征,利用基因组和转录组数据筛选克隆不同昆虫的非专一性核酸酶基因,并进行了基因同源性和表达分析。结果在斜纹夜蛾、二化螟、赤拟谷盗和灰飞虱体内分别克隆鉴定到了 6、5、5和2条非专一性核酸酶基因。它们都含有EndonucleaseNS保守域结构,并且含有保守的活性位点、底物结合位点和Mg2+结合位点。系统发育分析表明非专一性核酸酶基因家族可以分为不同的亚家族,每种昆虫具有1条Endonuclease G单基因亚家族的基因,赤拟谷盗还发现1条Deoxyribonuclease I亚家族基因,其余的均为dsRNase亚家族基因。组织表达分析发现,斜纹夜蛾、二化螟和赤拟谷盗体内分别具有3、2和2条中肠高量表达的dsRNase基因。灰飞虱唯一的dsRNase基因也是在中肠中表达量最高,只是与其他组织的表达量差异明显小于其他昆虫的中肠特异性dsRNase基因。分析不同虫态和龄期斜纹夜蛾的dsRNase基因的表达量和dsRNA降解酶活力发现,低龄幼虫（1～2龄）的基因表达量和酶活力显著低于高龄幼虫（3-6龄）。4 不同昆虫非专一性核酸酶基因的异源表达及其活性分析前文研究发现不同昆虫中存在多个dsRNases基因,然而并不是所有dsRNases基因的产物都具有dsRNA降解能力,为了解析不同dsRNases对dsRNA的降解能力,本章进一步利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统和sf9细胞对鳞翅目昆虫斜纹夜蛾和鞘翅目昆虫赤拟谷盗中的dsRNases以及半翅目昆虫灰飞虱中的dsRNase和EndoG基因进行了重组表达。通过杆粒分析确定表达载体的正确构建后,再通过蛋白免疫印迹实验进一步确认目标重组蛋白的表达。利用荧光法检测重组dsRNases的dsRNA降解活性,发现斜纹夜蛾中SldsRNase-1、SldsRNase-2、SldsRNase-3 和 SldsRNase-4 和赤拟谷盗中TcdsRNase-1以及灰飞虱中LsdsRNase具有降解dsRNA的能力,意味着斜纹夜蛾体内强大的dsRNA降解酶活力可能来源于多个dsRNases基因的作用。5 赤拟谷盗dsRNase基因的体内功能验证为了验证dsRNase在体内能够通过降解dsRNA来提高昆虫对RNAi耐性的功能,本研究以赤拟谷盗为试虫,首先通过靶向不同TcdsRNases的特异性dsRNA抑制不同dsRNase基因的表达,而后测定其体内降解dsRNA的能力变化,再测定对RNAi效率的影响。结果发现,沉默TcdsRNase-1后,赤拟谷盗dsRNA降解酶活力显著降低了95.7%,沉默TcdsRNase-2后,仅降低了 7.9%的酶活力,而沉默TcdsRNase-3和TcdsRNase-4后,赤拟谷盗dsRNA降解酶活力反而有所升高,分别升高了 12.7%和44.4%。表明赤拟谷盗体内dsRNA降解酶活力主要来自于TcdsRNase-1的作用。利用RNAi-of-RNAi手段验证该dsRNA降解酶基因TcdsRNase-1对RNAi效率的影响,发现当TcdsRNase-1的表达被抑制了 88.9%后,再通过注射或喂食一定量的标记基因dsRNA（靶向TcLac2a和TcCYP6BK13）,能够显著提升RNAi效率。在注射试验中,注射0.2 ng和2 ng靶向TcLac2a的dsRNA后,能够使RNA干扰效率分别提升58.2%和58.9%。注射2 ng和20 ng靶向TcCYP6BK13的dsRNA后,能够使RNA干扰效率分别提升38.6%和46.1%。在喂食试验中,喂食靶向TcLac2a和TcCYP6BK13的dsRNA,能够使RNA干扰效率分别提升54.0%和20.9%。这些结果充分表明消除赤拟谷盗体内的核酸酶后能够显著提升RNAi效率,有助于指导在害虫控制中dsRNA的高效利用。6 斜纹夜蛾dsRNase基因的体内功能验证斜纹夜蛾作为鳞翅目昆虫,前文研究发现其体内的dsRNases存在多个基因拷贝,并且大多数具有dsRNA降解活力。本研究通过比较食物对dsRNA降解酶活力及不同SldsRNases基因表达量的同步影响,初步鉴定出了斜纹夜蛾体内主导血淋巴和中肠液dsRNA降解活力的两个基因SldsRNase-1和SldsRNase-2。随后,利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除,结果发现,分别敲除SldsRNase-1和SldsRNase-2单个基因后,斜纹夜蛾纯合突变体中dsRNA降解酶活力分别下降了 79.3%和40.4%,而同时敲除两个基因后,双基因敲除品系（SL1SL2KO）的dsRNA降解酶活力下降了 96.3%,其中肠液和血淋巴液中dsRNA降解酶活力分别下降了 83.2%和23.3%。基因干扰实验发现,喂食dsRNA后,SL1SL2KO品系血淋巴中的dsRNA含量峰值是WT品系的将近20倍,但是其持续时间差异不大,只有8分钟左右。筛选出斜纹夜蛾体内可以产生显著干扰效应的靶标基因,进一步比较了WT品系和SL1SL2KO品系的注射和喂食RNAi效果。结果发现注射dsRNA后,SL1SL2KO品系中的靶基因表达抑制率稍高于WT品系,但差异不显著。喂食后,SL1SL2KO品系中的抑制率达到23.2%,显著高于WT品系。综上结果表明SldsRNase-1和SldsRNase-2确实是斜纹夜蛾体内主导整体dsRNA降解活力的基因,并且可能被食物携带因子诱导。敲除这两个基因能在一定程度上提高RNAi效率,但是提升的幅度有限,预示着敲除SldsRNase-1和SldsRNase-2后,其他基因转录翻译的核酸酶仍可使斜纹夜蛾表现出RNAi不敏感。此外,比较发现,SL1SL2KO品系中产卵的成虫数量、卵块数量以及孵化出幼虫的卵块数量均明显低于WT品系,而孵化后幼虫至成虫的发育历期差异不大,表明这两个基因敲除后对斜纹夜蛾生殖影响较大。