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DNA甲基化（DNA methylation）通常是指由甲基转移酶催化的胞嘧啶环上的甲基修饰,形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-meC）。大量研究表明,DNA甲基化修饰在胚乳基因印记、转座子运动、转基因沉默以及mRNA加工过程都发挥着重要作用。与DNA甲基化过程相反,高等生物体内还存在着一个拮抗DNA甲基化的过程,被称为DNA去甲基化（DNA demethylation）。DNA去甲基化在调控沉默基因的激活和染色体的解聚等过程中扮演着重要的角色。在拟南芥,目前被公认的DNA去甲基化作用是通过DNA糖基化酶/裂合酶（DNA glycosylase/lyase）介导的碱基切除修复（base excision repair,BER）过程来完成,涉及的蛋白因子包括ROS1（Repressor of Silencing 1）,DME（DEMETER）,DML2（DEMETER-LIKE protein 2）和DML3（DEMETER-LIKE protein 3）。ROS1的主要作用是在特定位点上去除由siRNA介导的DNA甲基化途径（RNA-dependent DNA methylation,RdDM）产生的 DNA 甲基化,拮抗由于过度DNA 甲基化造成的基因沉默。研究发现,ROS1的去甲基化功能需要一系列蛋白因子参与,创造出一种合适的染色质环境,从而暴露出甲基化的DNA位点,使ROS1及相关因子能够结合上去执行去甲基化作用。为了鉴定新的参与ROS1介导的DNA去甲基化过程的蛋白因子,完善DNA去甲基化途径,我们利用甲基化敏感酶消化-聚合酶链式反应（methylation-sensitive enzyme digestion-PCR,Chop-PCR）技术筛选与ROS1共表达（co-expression）的基因的T-DNA插入突变体库,用于寻找与ros1-4相似、在Chr2:10591372-10592250位点上也有甲基化升高的突变体,最终筛选到了crwn3(CROWDED NUCLEI3突变体。深入研究结果表明,CRWN3与ROS1在功能上有许多类似的方面,很有可能CRWN3在种子萌发期帮助ROS1发挥去甲基化作用,从而促进染色质的解压缩。本研究获得的主要结果包括以下三个方面:1.CR WN3突变引起基因组DNA甲基化水平显著升高CRWNs蛋白家族有四个成员,CRWN1和CRWN4被报道参与维持细胞核的尺寸;它们的突变体的细胞核形态明显变小。为了检验它们是否都参与DNA去甲基化过程,我们获得了这四个基因的单突变体。通过杂交和CRISPR/CAS9方法构建了 crwn1 crwn2,crwn2crwn3,crwn3 crwn4和crwn3 crwn1CR（crwn1是通过CRISPR/CAS9技术获得的）四种双突变体。表型观察发现,除了crwn3 crwn1CR有植株变矮的发育表型外,其余双突变体均无明显发育缺陷表型。Chop-PCR实验结果表明,CRWN基因家族的四个单突变体中,只有crwn3突变体具有类似ros1-4的超甲基化表型,说明CRWN3可能已经特化成为协助ROS1执行去甲基化功能的蛋白。RT-PCR实验结果表明,crwn3突变体中,ROS1、ROS3、IDM1、IDM2的表达量都没有明显改变,表明CRWN3参与DNA去甲基化作用并不是通过影响这些基因的表达水平而实现的。全基因DNA甲基化测序结果表明,crwn3（3周龄幼苗）基因组包含2,557个超甲基化位点（hypermethylation loci）;其中,与ros1-4突变体重合的超甲基化位点共有1,082个,并且几个重合的超甲基化位点已经被Chop-PCR所验证,表明了CRWN3和ROS1之间功能上的相关性。此外,crwn3与nrpd1和rdm1的双突变体crwn3 nrpd1和crwn3 rdm1在一些位点几乎完全丢失了由CRWN3突变引起的超甲基化,表明CRWN3的作用位点与RdDM途径的作用位点有一定的重合。然而,与ROS1拮抗基因沉默（anti-silencing）的功能不同,当C24-LUC/Col-0（其遗传背景已经被代换成Col-0）中引入crwn3突变后,其LUC荧光强度和卡那霉素抗性与C24-LUC/Col-0非常相似,表明CRWN3并不像ROS1一样具有拮抗转基因沉默的功能。2.CRWN3与ROS1的关系为了深入探索crwn3突变体甲基化升高的原因及CRWN3与ROS1的关系,我们构建了 crwn3 ros1双突变体。Chop-PCR实验结果表明,双突变体在Chr1:13,477,554-13,477,896位点上呈现出比单突变体更高的甲基化水平;全基因组DNA甲基化测序结果表明,crwn3 ros1双突变体中大量超甲基化位点的甲基化水平明显高于各个单突变体,尤其表现在这些位点的甲基化向双侧或单侧扩散,但超甲基化位点总数并没有显著变化,表明CRWN3与ROS1确实在同一个遗传途径里,CRWN3的主要功能是协助ROS1阻止甲基化位点在染色体上的扩散。考虑到CRWN3是ROS1的共表达基因,而且在DNA去甲基化方面与ROS1的功能相关,我们推测他们之间可能存在基因表达调控关系或蛋白相互作用。RT-PCR实验结果表明,crwn3突变体中与DNA去甲基化有关的重要基因（如ROS1、ROS3、IDM1、IDM2）的表达水平并没有明显变化,表明CRWN3突变引起甲基化水平升高不是通过影响这些基因的表达水平而实现的。酵母双杂交（yeast two hybrid,Y2H）实验结果表明,CRWN3的N端（CRWN3-N）与ROS1的N端（ROS1-N）有较强的蛋白相互作用;双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）实验也验证了 CRWN3-N与ROS1-N的互作关系,并且发现互作发生在细胞核内。萤火虫荧光素酶互补成像（firefly luciferase complementation imaging,LCI）实验再次验证了CRWN3与ROS1的相互作用。综上所述,这些结果表明了 CRWN3与ROS1很可能通过直接蛋白相互作用而形成蛋白复合体,共同发挥DNA去甲基化作用。3.CRWN3与ROS1在种子萌发期共同促进染色质解压缩前人的研究表明,在种子萌发初期（第2-5天）,ROS1能够活跃地降低5S rDNA上的甲基化水平并促进此串联重复区段的染色质解压缩,暗示了 ROS1在染色体解压缩方面的重要作用。Southern blot结果表明,与ros1突变体相似,萌发期的crwn3单突变体和crwn3 ros1双突变体中,5S rDNA的去甲基化程度被削弱,表明了CRWN3与ROS1一起共同促进5S rDNA的去甲基化。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验结果显示,5S和45S rDNA在萌发期的crwn3 ros1双突变体中的解压缩被明显削弱,表明CRWN3和ROS1在种子萌发期协同作用,共同促进5S和45S rDNA区段的解压缩。染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验结果表明,crwn3 ros1双突变体中5S和45S rDNA启动子上的组蛋白H3K9me2水平有一定程度的升高,这可能与它们的DNA甲基化水平较高和染色质紧密压缩有关。此外,另一个ChIP实验结果表明,CRWN3突变造成ROS1对部分靶位点的结合能力减弱,说明ROS1在特定目标位点的结合需要CRWN3的协助。ABI3（ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 3）被报道在种子成熟过程中促进染色质的紧密压缩。通过Y2H实验,我们发现CRWN3与ABI3也存在直接蛋白相互作用。我们在野生型（Col-0）中检测了种子萌发初期ABI3、CRWN3、ROS1的表达量,结果表明ABI3的表达量自种子萌发开始呈持续下降趋势,而ROS1的表达量呈现出急剧升高的趋势,在第4天达到高峰;CRWN3的表达量则呈现出先升高再下降的趋势。进一步研究发现,crwn3 ros1双突变体中ABI3的表达量在萌发初期本底表达水平显著高于野生型和各个单突变体,且随着时间延长表达下降的速度减慢。这些结果表明,CRWN3和ROS1很可能协同作用,拮抗ABI3的效应,共同促进这一时期的染色质解压缩。crwn3 ros1双突变体在正常萌发条件下表现出萌发速度明显减慢的表型;而外源施加ABA则强烈抑制它的萌发,暗示了双突变体内ABA含量可能升高。利用液相色谱-质谱（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS）技术检测ABA含量的实验表明,双突变体内的ABA含量明显高于野生型和单突变体,表明CR WN3和ROS1双突变会以某种方式促进ABA合成量的增加。综上所述,本研究通过分析CRWN3在ROS1介导的DNA去甲基化过程中的作用,发现CRWN3很可能与ROS1在体内形成蛋白复合体,阻止甲基化位点在染色体上的扩散。此外,此复合体也发挥着促进种子萌发时期5S和45S rDNA区段染色质的去甲基化和解压缩的作用。所有这些研究结果进一步加深了我们对ROS1介导的DNA去甲基化过程分子机理的认识。