论文部分内容阅读
背景:糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）为糖尿病的常见并发症,发病机制复杂且尚未明确。目前,大量研究发现,TLR4信号通路在DN发生发展中发挥重要作用,抑制TLR4信号通路的表达将有助于改善DN。本课题组前期研究发现,杨桃根单体化合物2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮（DMDD）具有降低糖尿病小鼠空腹血糖、明显改善尿蛋白、减轻糖尿病小鼠肾脏损伤的作用,然而作用机制仍需深入研究。近期实验发现,DMDD可作用于TLR4信号通路对高脂所致胰岛素抵抗小鼠具有保护作用;同时,抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路显著性地抑制棕榈酸诱导的胰岛MIN6细胞炎症反应及细胞凋亡。基于前期研究,本实验推测DMDD可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路延缓糖尿病肾病。目的:本文主要研究杨桃根DMDD对糖尿病肾损伤及高糖所致足细胞损伤的保护作用及其DMDD对TLR4/My D88/NF-κB信号通路表达的影响,探寻DMDD延缓糖尿病肾病的作用机制。方法:⑴体内实验:采用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）100mg.kg-1建立TLR4野生型（wild type,WT）和TLR4敲除型（knockout type,KO）糖尿病小鼠模型。予高糖高脂饲料喂养小鼠,随后腹腔注射低剂量STZ100mg.kg-1,72h后测量小鼠空腹血糖≥11.1mmol/L设为糖尿病小鼠。将造模成功的野生型和敲除型糖尿病小鼠随机分为以下5组:糖尿病肾病模型组（diabetic nephropathy,DN,予生理盐水）、阳性对照组(gliquidone group,G,予格列喹酮10 mg.kg-1.d-1)、DMDD高剂量组(high dosage group,H,予DMDD50 mg.kg-1.d-1)、DMDD中剂量组(medium dosage group,M,予DMDD25 mg.kg-1.d-1)、DMDD低剂量组(low dosage group,L,予DMDD12.5 mg.kg-1.d-1)。另外,分别设立TLR4野生型和敲除型的正常对照组（normal control group,NC,予生理盐水）。连续给予格列喹酮和DMDD干预4周后,拔眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠,取肾脏组织。测定血清肌酐（serum creatine,Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、胱抑素-C（Cystatin-C,Cys-C）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）等,ELISA测定炎症因子白细胞介素-1β（interleukin-1,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）等;HE染色观察肾脏组织病理变化情况,电镜观察肾足细胞超微结构改变,TUNEL测定肾组织细胞凋亡情况;分别采用PCR和免疫组化观察TLR4、My D88、NF-κB m RNA和蛋白表达情况,Western Blot测定TLR4/My D88/NF-κB信号通路蛋白表达水平。⑵体外实验:小鼠肾永生化足细胞株（MPC5）为对象,采用高糖（30mmol/L）构建MPC5细胞损伤模型。CCK-8法测定不同浓度DMDD对MPC5细胞活性和毒性情况,确定IC50及DMDD给药浓度。AO/EB方法及流式细胞分析术检测MPC5细胞凋亡情况,ELISA测定IL-6和TNF-α分泌水平,PCR和Western Blot测定TLR4、My D88、NF-κB m RNA和蛋白变化情况。结果:1.体内实验结果:（1）高糖高脂饮食联合腹腔注射100mg.kg-1STZ的方法成功诱导建立小鼠糖尿病模型,经过DMDD干预4周后,发现DMDD降低糖尿病小鼠的空腹血糖,降低肾组织重量,改善胰岛素抵抗和糖耐量,降低血清肌酐、尿素氮、胱抑素-C及尿蛋白含量（P<0.05）,同时改善血脂紊乱的现象,下调TG、TC、LDL并升高HDL的水平,但给予DMDD后,WT型糖尿病小鼠与KO型糖尿病小鼠的上述结果进行比较,并无明显统计学意义。（2）HE染色和电镜结果:糖尿病小鼠肾小球体积增大,基底膜增厚,炎症浸润;DMDD干预后,糖尿病小鼠的肾组织损伤得到不同程度的改善。电镜观察,糖尿病小鼠肾基底膜增厚,足突融合严重,足细胞数量减小;DMDD干预后,足突融合减小,足细胞数量增多。（3）TUNEL结果:DN组小鼠肾脏细胞凋亡明显增多,DMDD干预后,凋亡的肾细胞数量减小;与WT型比较,KO型糖尿病小鼠经DMDD治疗后,其肾细胞凋亡数量下降。（4）ELISA结果:与模型组小鼠比较,DMDD高剂量明显地抑制炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1的水平,增加IL-10的含量（P<0.05）;同时,予DMDD高剂量后,KO型糖尿病小鼠IL-6和TNF-α含量低于WT型糖尿病小鼠（P<0.05）。（5）免疫组化结果:与NC组比较,DN组小鼠肾组织中TLR4、My D88、NF-κB、IL-6及TNF-α蛋白表达明显增多;DMDD干预后,糖尿病小鼠肾组织中TLR4、My D88、NF-κB、IL-6及TNF-α蛋白表达下降。与WT型小鼠比较,DMDD治疗后,KO型糖尿病小鼠My D88、NF-κB、IL-6及TNF-α表达减小。（6）PCR和Western Blot结果:WT型小鼠,与NC组小鼠比较,DN组小鼠TLR4、My D88、NF-κB的表达增加,TLR4/My D88/NF-κB信号通路被激活;而经DMDD干预4周后,TLR4、My D88、NF-κB的m RNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）,TLR4信号通路被抑制。KO小鼠TLR4的m RNA和蛋白表达量极小。经DMDD高剂量干预后,相比于WT型糖尿病小鼠,KO小鼠的My D88、NF-κB的m RNA和蛋白表达降低。2.体外实验结果:采用CCK-8的方法检测DMDD对足细胞的半数抑制浓度(IC50)为60μmol/L,综合考虑药物毒性及高糖刺激诱导足细胞凋亡的影响,确定DMDD用于高糖所致足细胞损伤的低、中、高浓度分别为:1.875、3.75、7.5μmol/L。与低糖培养的细胞（5.5 mmol/L,LG）比较,高糖刺激足细胞48h,高糖组（30 mmol/L,HG）的足细胞凋亡明显增加,给予DMDD24h后,DMDD组的足细胞凋亡率减小（P<0.05）;流式结果也验证,暴露在高糖环境下的足细胞,细胞凋亡率明显高于低糖组,然而加入DMDD干预后,高糖所致足细胞的细胞凋亡率降低（P<0.05）;ELISA结果,DMDD明显降低高糖所致足细胞损伤时生成的炎症因子IL-6和TNF-a的水平,且与未加入TLR4抑制剂TAK-242比较,加入TAK-242后,DMDD下调IL-6和TNF-a的趋势更显著（P<0.05）;Western Blot方法检测TLR4、My D88、NF-κB的蛋白表达结果,发现,相对于LG组,HG组的TLR4、My D88、NF-κB蛋白表达增多,而同HG组比较,DMDD高剂量组降低TLR4、My D88、NF-κB水平,增加TAK-242后,DMDD对TLR4、My D88、NF-κB的抑制作用更明显（P<0.05）;此外,PCR结果显示,DMDD能明显降低TLR4、My D88、NF-κB m RNA表达水平（P<0.05）。结论:（1）DMDD通过抑制TLR4/My D88/NF-κB通路延缓糖尿病肾病;（2）DMDD对高糖所致的足细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路介导。