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冠状动脉微栓塞(Coronary Microembolizaiton,CME)常见于冠状动脉粥样斑块的自发侵蚀、破裂及经皮冠脉成形术(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)中斑块碎裂等情况。PCI是急性冠脉综合征(Acute Coronary syndrome,ACS)的首选再灌注策略,但即使在成功的PCI术后,心绞痛症状可能仍然存在,CME可能是潜在的重要原因。CME的防治措施主要包括药物治疗和器械保护,目的是为了减少心肌微梗死灶面积,降低缺血再灌注损伤,但其能否预防微栓子的形成、减少微梗死发生,减轻微循环功能不全,还仍需要进一步的研究。我们前期研究发现,CME大鼠心肌微梗死区域的心肌细胞凋亡、炎症相关蛋白表达水平明显上升,提示细胞凋亡、炎症参与了CME致心肌损伤。本课题组前期研究也探讨了CME时心肌组织自噬的作用,CME后心肌组织自噬水平显著下降,经自噬抑制剂3-MA处理大鼠,CME后自噬水平进一步降低,但心肌细胞凋亡明显增加,说明了在CME的环境中,自噬起到了心肌保护作用。自21世纪初以来,随着新一代测序及芯片技术的出现,涉及心血管病的病理生理条件的非编码核糖核酸(non-coding RNA,nc RNA)分子机制研究成为热点。微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)是研究最多的非编码核糖核酸,我们前期研究也探讨了miRNA调控CME致心肌损伤作用。长链非编码核糖核酸(Long non-coding RNA,lncRNA)位于细胞核或者细胞胞质里,有研究表明它能在多方面调控m RNA的表达水平。但lncRNA在CME所致心肌损伤中的具体作用尚未清楚,特别是lncRNA在CME后是否存在心脏自噬的调控作用,目前尚无报道。本研究通过高通量基因芯片技术选取表达显著变化的lncRNA LOC102552184,再经过生物信息学数据库比对预测miR-146a-5p/TRAF6可能为LOC102552184潜在作用靶点。预实验对lncRNA LOC102552184、miR-146a-5p及TRAF6进行RT-qPCR验证表明,LOC102552184在CME后表达明显升高,miR-146a-5p下降,TRAF6表达显著上调。由此我们提出假设:抑制LOC102552184表达,能否提高心肌自噬,抑制凋亡、炎症反应,进而改善心功能?抑制LOC102552184能否靶向miR-146a-5p/TRAF6,从而促进自噬、抑制凋亡、炎症,改善CME致心肌损伤?为了进一步证实这一假设,本实验分别从在体大鼠冠脉微循环栓塞模型、体外原代心肌细胞培养进行研究,为探寻CME的新精准医学药物治疗靶点提供重要理论依据。第一部分LOC102552184对冠状动脉微栓塞致心肌损伤影响的研究目的:研究lncRNA LOC102552184在大鼠CME所致心肌损伤中的作用以及LOC102552184对CME后心肌组织凋亡、局部炎症和自噬的影响。方法:30只SD大鼠随机分为成5组:Sham组(假手术组)、CME组、CME+空载腺相关病毒组(CME+AAV-control组),CME+LOC102552184过表达腺相关病毒组(CME+AAV-LOC102552184组)、CME+LOC102552184抑制腺相关病毒组(CME+AAV-sh RNALOC102552184组),每组6只。CME+AAV-control组,CME+AAVLOC102552184组、CME+AAV-sh RNA-LOC102552184组经尾静脉微泵注射方式转染装载了空白病毒载体、LOC102552184过表达质粒、sh RNALOC102552184的重组9型腺相关病毒。三周后行大鼠CME造模,大鼠开胸后夹闭主动脉,左心室注射45μm规格聚乙烯微球,假手术组大鼠注射同等量0.9%生理盐水到左心室。建模9小时后,行心脏超声心动图检测各组大鼠心脏功能状态。再次麻醉大鼠后,开胸剪取左心室心肌组织,心肌组织凋亡指数通过TUNEL染色进行,透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察心肌细胞自噬。RT-qPCR、Western blot检测当过表达/抑制lncRNA LOC102552184时,凋亡相关蛋白(Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9和BCL-2)、自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5和p62)及炎症相关蛋白(IL-1β、TNF-α和NFk B)的蛋白相对表达量水平。结果:1.心脏超声结果显示,与Sham组相比较,CME组大鼠心功能显著降低;过表达LOC102552184时,CME后心功能进一步恶化,抑制LOC102552184表达则可改善CME后心功能损伤。2.TUNEL染色显示,与CME组相比,过表达LOC102552184后心肌凋亡指数增加明显;抑制LOC102552184表达水平,心肌细胞凋亡指数明显下降。3.TEM观察结果表明,与CME组相比,过表达LOC102552184后,自噬体及自噬溶酶体明显减少;抑制LOC102552184表达后心肌自噬体及自噬溶酶体明显增加。4.Western blot结果提示:过表达LOC102552184后,凋亡相关Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和Cleaved caspase-9蛋白表达水平上升明显、Bcl-2表达水平下降明显;自噬相关LC3Ⅱ、Beclin-1和ATG5蛋白表达水平明显下降、p62表达水平明显升高;炎症相关IL-1β、TNF-α、NF-k B蛋白表达明显上升。而抑制LOC102552184表达,则可减轻CME所致的心肌细胞凋亡和心肌组织炎症,促进心肌组织自噬。结论:lncRNA LOC102552184可通过加重炎症、促进凋亡、抑制自噬造成CME后心肌损伤。第二部分LOC102552184对心肌细胞缺血缺氧损伤影响的研究目的:本研究通过建立大鼠原代心肌细胞缺血缺氧(IH)模型,旨在探索lncRNA LOC102552184对心肌细胞缺血缺氧损伤的影响。方法:体外培养SD新生乳鼠心肌细胞,取IH 9小时为干预时间点,将心肌细胞随机分为阴性对照组(Con组),缺血缺氧组(IH组),缺血缺氧+空载慢病毒组(IH+Lenti-control组)和缺血缺氧+LOC102552184抑制慢病毒组(IH+Lenti-sh RNA-LOC102552184组),每组10只新生SD大鼠备取心肌细胞。以无血清培养基模拟缺血环境,缺氧培养罐模拟缺氧环境。IH+Lenti-control组和IH+Lenti-sh RNA-LOC102552184组分别转染装载有空载慢病毒和sh RNA-LOC102552184慢病毒。使用MTS法行心肌细胞活力测试,乳酸脱氢酶(LDH)检测法检测心肌损伤程度。流式细胞术对心肌细胞凋亡程度进行评估。TEM观察心肌细胞的显微镜下超微结构、线粒体、自噬体、自噬溶酶体。m RFP-GFP-LC3慢病毒转染心肌细胞后,通过激光共聚焦显微镜评估心肌细胞自噬流的变化情况。Western blot检测心肌细胞凋亡相关(Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9、BCL-2)蛋白、自噬相关(LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5、p62)蛋白以及炎症相关(IL-1β、TNF-α、NF-k B)蛋白的表达。结果:1.心肌细胞活力测试结果提示:与Con组比,IH组心肌细胞活性显著降低;与IH组比,抑制LOC102552184表达心肌细胞活性显著升高,心肌细胞损伤明显改善。2.流式细胞术检测心肌凋亡提示:抑制LOC102552184表达后,心肌细胞IH后凋亡显著减少。3.透射电子显微镜观察发现,在IH环境下,可观察到细胞线粒体水肿、空泡化;与IH组相比,抑制LOC102552184表达后可见心肌自噬体及自噬溶酶体明显增加,线粒体水肿明显减轻。激光共聚焦检测心肌细胞自噬流提示,沉默LOC102552184表达时,自噬流明显增强。4.Western blot检测结果提示,抑制LOC102552184表达后,IH心肌细胞的凋亡相关Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9蛋白表达明显下降,Bcl-2表达水平明显增加;自噬相关LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5蛋白表达显著上调,p62显著下降;炎症相关IL-1β、NF-k B、TNF-α蛋白表达显著下调。结论:抑制LOC102552184通过促进自噬,抑制凋亡和炎症反应减轻心肌细胞缺血缺氧损伤。第三部分LOC102552184靶向miR-146a-5p/TRAF6调控冠状动脉微栓塞所致心肌损伤目的:本研究旨在探索lncRNA LOC102552184靶向miR-146a-5p/TRAF6调控冠状动脉微栓塞所致心肌损伤的机制。方法:将30只SD大鼠随机原则分5组:假手术组(Sham组)、CME组、CME+空载腺相关病毒组(CME+AAV-control组),CME+LOC102552184过表达腺相关病毒组(CME+AAV-LOC102552184组)、CME+LOC102552184抑制腺相关病毒组(CME+AAV-sh RNALOC102552184组),每组6只。CME+AAV-control组,CME+AAVLOC102552184组、CME+AAV-sh RNA-LOC102552184组分别经尾静脉转染有空白病毒对照、LOC102552184过表达质粒、sh RNA-LOC102552184的重组9型腺相关病毒,转染三周后建立CME模型。开胸夹闭主动脉并经左心室注射45μm聚乙烯微球建立CME模型,Sham组经左心室注射同等量生理盐水。双荧光素酶报告验证LOC102552184和miR-146a-5p是否有结合能力。荧光原位杂交(FISH)法定位LOC102552184。RT-qPCR检测CME时心肌组织miR-146a-5p及TRAF6的表达。Western blot测心肌TRAF6表达水平。结果:1.双荧光素酶检测提示:miR-146a-5p与LOC102552184能结合,并抑制其表达。2.FISH检测提示:LOC102552184主要在细胞浆表达。3.RT-qPCR和Western blot结果显示:与CME组相比较,CME+AAVLOC102552184组大鼠miR-146a-5p表达水平明显下调,TRAF6蛋白表达水平明显上调。而抑制LOC102552184后,miR-146a-5p表达水平明显上升,TRAF6表达水平显著下降。4.通过RT-qPCR结果比较LOC102552184、miR-146a-5p、TRAF6之间的表达水平的相关性分析提示,LOC102552184表达与miR-146a-5p表达呈明显负相关(r=-0.8440,P<0.05),与TRAF6呈正相关(r=0.8929,P<0.05);miR-146a-5p与TRAF6表达呈负相关(r=-0.8591,P<0.05)。5.Western blot结果比较TRAF6表达与凋亡、自噬、炎症相关蛋白表达的相关性分析结果提示,Cleaved caspase-3表达与TRAF6表达呈正相关(r=0.974,P<0.05);LC3 II表达与TRAF6表达呈负相关(r=-0.8355,P<0.05);NF-k B表达与TRAF6表达呈正相关(r=0.974,P<0.05)。结论:LOC102552184可通过吸附miR-146a-5p靶向调节TRAF6加重CME后心肌凋亡和炎性损伤,并抑制自噬,从而导致心肌损伤。