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背景:急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,缩写为AML)主要是以骨髓和外周血中原始与幼稚髓性细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍为主要特征。因急性髓系白血病致死率高,预后容易复发,而临床常用的化疗法副反应多、患者耐受力差,干细胞移植法配型困难、费用昂贵,故在规范的现代医学治疗基础上,从中药中寻找出替代性药物成为了新的治疗手段。苏木(Caesalpinia sappan L.)为豆科植物苏木的干燥芯材,具有活血化瘀的功效。在传统上,苏木常被用于治疗例如破伤风、疼痛以及妇女凝血等疾病[1]。现代药理学将苏木用于肿瘤等疾病的治疗,但是其治疗白血病作用机制以及药效物质基础还未阐明。本研究拟对苏木乙酸乙酯部位抗急性髓系白血病有效部位与药效机制进行初步评价。目的:明确苏木抗急性髓系白血病的活性组分,并且阐明对急性髓系白血病细胞的抑制增殖,诱导凋亡及促进分化作用和初步机制。方法:(1)苏木抗急性髓系白血病活性组分的筛选苏木先经过水提后,用系统溶剂萃取法进行萃取,得到乙酸乙酯、石油醚、水饱和正丁醇与水四个部位;再用高效液相色谱法对不同的部位进行组分分析,然后用SRB法检测苏木水提物以及其不同萃取部位对HL-60细胞的抑制率,明确苏木的有效部位。(2)苏木乙酸乙酯部位对诱导急性髓系白血病细胞生长抑制作用先用SRB法检测苏木乙酸乙酯部位(C-A-E)对不同细胞生长的影响,后用台盼蓝拒染法和甲基纤维素克隆形成实验来检测AML细胞的增殖能力以及克隆形成能力的影响。(3)苏木乙酸乙酯部位诱导线粒体途径细胞凋亡机制研究用流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI双染分析C-A-E对HL-60和Kasumi-1细胞的凋亡水平,之后加入泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK用SRB法检测细胞生长;再用JC-1法检测C-A-E对线粒体膜电位的影响,用免疫荧光法检测细胞色素c的释放;Western blotting法检测苏木乙酸乙酯提取物对细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-caspase 9、cleaved-caspase 9的表达,并且用caspase 3、caspase 9活性试剂盒检测活性。(4)苏木乙酸乙酯部位诱导线粒体分裂机制研究用SRB法检测加入线粒体分裂抑制剂Mdivi-1以及线粒体分裂激活剂FCCP后的细胞存活,之后用Western blotting法检测C-A-E对线粒体分裂蛋白Fisl、Mff的影响,再用流式细胞术检测加入Mdivi-1对C-A-E诱导凋亡的影响,然后用免疫荧光法检测了 Drpl的易位。(5)苏木乙酸乙酯部位对急性髓系白血病细胞分化及周期的影响先用瑞氏吉姆萨染色法检测C-A-E对AML细胞分化形态的影响,之后用硝基四氮唑蓝(NBT)-还原活性实验检测AML细胞NBT 阳性细胞率。再用流式细胞术检测C-A-E对细胞分化标记物CD11b和CD14表达以及细胞周期,最后用Western blotting法检测C-A-E对周期蛋白的影响。(6)活性氧对苏木乙酸乙酯部位诱导急性髓系白血病细胞凋亡和分化的影响为研究活性氧(ROS)是否参与了 C-A-E诱导的细胞凋亡,首先要检查C-A-E对细胞ROS产生的影响,之后,C-A-E和活性氧清除剂(NAC)合用,以流式细胞术检测细胞凋亡后继续检测分化标记物CD11b和CD14的表达以及细胞周期。(7)苏木乙酸乙酯部位对AML-NOD/SCID小鼠模型的作用将NOD/SCID小鼠进行X射线照射,尾静脉注射HL-60细胞,构建AML-NOD/SCID小鼠模型。考察小鼠的脏器指数、生存时间,用全自动动物血液分化仪检测小鼠的血液生理指标,再用HE染色检测小鼠的肝脾浸润,用免疫组织化学染色检测CD45表达情况。结果:(1)苏木水提物及其乙酸乙酯部位具有显著抑制急性髓系白血病细胞作用SRB法检测的结果显示,苏木水提物对HL-60细胞有着明显的存活率抑制作用(IC50=0.26mg/mL);用系统溶剂萃取法对苏木水提物进行分离后,SRB法检测的结果显示,和其他三个部位比较,C-A-E对HL-60细胞的存活表现出了最显著抑制作用(IC50=0.19 mg/mL),再用HPLC法对苏木不同提取部位分别进行检测分析,测定结果显示了 C-A-E主要含quercetin、brazilin、protosappanin B、sappanone B、4-o-hydroxybrazilin 等成分。(2)苏木乙酸乙酯部位抑制AML细胞的生长测定了 C-A-E对其他不同AML细胞的抑制作用。发现C-A-E以浓度依赖性方式有效的抑制了 HL-60和Kasumi-1细胞生长,而对U937、K562、OCI-AML3和MV-4-11细胞中则显示出了相对弱的活性。克隆形成试验表明C-A-E的处理明显减少了 HL-60及Kasumi-1细胞集落的数量及大小。(3)苏木乙酸乙酯部位诱导AML细胞线粒体途径凋亡流式细胞仪测定的结果显示C-A-E浓度依赖性地诱导HL-60与Kasumi-1细胞凋亡,与此同时,泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK也明显逆转了 C-A-E诱导的细胞死亡。C-A-E还明显降低MMP水平并且显著的促进细胞色素c从线粒体中的释放。Western blotting的结果显示C-A-E明显诱导了 Bax表达并且降低了Bcl-2表达。而且C-A-E显著降低了 pro-caspase 3与pro-caspase 9的水平,也提高了 cleaved-caspase 3 与 cleaved-caspase 9 的水平。(4)苏木乙酸乙酯部位诱导AML细胞的线粒体分裂以Mdivi-1预处理明显减弱了 C-A-E对HL-60细胞的细胞存活的抑制作用和细胞凋亡率。Western blotting结果显示C-A-E以浓度依赖性方式上调Mff与Fis1的表达。免疫荧光法结果也表明,线粒体中Drp1的水平显著增强。(5)苏木乙酸乙酯部位诱导AML细胞周期阻滞及促进分化瑞氏吉姆萨染色法表明在C-A-E处理的AML细胞中观察到了典型的分化形态特征,之后NBT还原法测定又显示C-A-E处理使NBT 阳性细胞率以浓度依赖性的增加。而且C-A-E在AML细胞中增加了分化标志物CD11b和CD14的表达。此外C-A-E还诱导了 G2/M期周期阻滞,并且上调了周期蛋白CDK1、CyclinB1的表达。(6)ROS参与了苏木乙酸乙酯部位诱导的AML细胞线粒体凋亡、周期及分化C-A-E处理后增加了 AML细胞的细胞内ROS水平。用ROS清除剂NAC预处理能够明显减轻C-A-E对AML的细胞存活的抑制作用。更加重要的是,以NAC预处理能够明显减低C-A-E诱导的AML细胞凋亡。与此同时,NAC预处理还明显降低了 C-A-E对分化标记物CD14和CD11b水平的增强作用。另外,NAC还显著减少了 C-A-E诱导的G2/M期周期阻滞。(7)苏木乙酸乙酯部位在NOD/SCID小鼠中显示出抗AML活性C-A-E组的患病小鼠在给药的第35天后停止死亡,模型组的小鼠则继续死亡直至第40天实验结束。血液的生理参数测定显示,C-A-E组中,白细胞计数显著减少。免疫组织化学染色结果显示,C-A-E处理减少了 CD45在脾脏、肝脏及骨髓中的表达。此外,C-A-E还明显降低了肝脾肿大,改善了骨髓细胞的比例。结论:C-A-E具有明显的抑制急性髓系白血病细胞作用,通过激活线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡并促进线粒体分裂,还促进了急性髓系白血病细胞分化,诱导G2/M期周期阻滞。C-A-E诱导的凋亡、分化和周期阻滞是由ROS介导。同时,C-A-E能明显延长患病小鼠的生存时间,改善生存状态,延缓疾病病程,表现出其具有抗急性髓系白血病的作用。