背景:支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia,BPD）是新生儿尤其是早产儿最常见的慢性肺部疾病,其发病率和死亡率高,严重威胁婴幼儿尤其是早产儿的生命。虽然围产期和新生儿医学在提高早产儿存活率方面取得重大进展,但在BPD治疗方面进展缓慢。在传统医学领域中,临床干预和治疗手段的创新与探索仍不能从根本上改善严重BPD的预后。因此,迫切需要一种新型有效的干预与治疗方式来解决这一难题。近年来,间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）移植为BPD的治疗提供了新的治疗策略。脐带间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）作为一种具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,其低免疫原性和免疫调节特性,使其成为MSCs移植治疗免疫相关疾病的理想来源。虽然早期的临床研究显示了MSCs的安全性,但临床有效性受到争议。因此,探究影响MSCs免疫调节活性的因素是发展其有效治疗策略的关键。体外大量扩增是MSCs在临床应用中必经的一个过程,伴随的复制性衰老可能是影响MSCs临床应用有效性的重要原因之一。研究发现,复制性衰老的细胞显示出较低的免疫调节能力,因此减缓MSCs的衰老可能有利于其免疫抑制能力发挥。核因子NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是进化上保守的转录因子,与抗氧化反应元件（antioxidant responsive element,ARE）相互作用调节编码抗氧化蛋白,Nrf2/ARE是机体自身防御的重要机制,在减少细胞凋亡、延缓衰老和减少器官氧化损伤等多方面有着重要作用。研究发现,Nrf2介导的细胞抗氧化通路的紊乱是导致细胞衰老的重要驱动力之一,激活Nrf2可以延缓间充质干细胞衰老的进程。本实验将探讨Nrf2是否参与调节UC-MSCs治疗高氧致BPD新生大鼠的治疗效果,并初步探讨Nrf2在UC-MSCs复制性衰老以及免疫抑制过程中发挥的作用,以期进一步理解Nrf2在调节UC-MSCs的免疫抑制能力的潜在作用机制。第一部分敲低Nrf2减弱UC-MSCs对高氧致新生大鼠BPD模型的治疗效果目的:探讨Nrf2是否参与调节UC-MSCs移植治疗高氧致新生大鼠BPD治疗效果。方法:细胞实验:体外培养UC-MSCs,流式细胞术检测细胞特异性表面标志物;油红O染色检测其成脂分化能力,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化能力。siRNA转染UC-MSCs,分为阴性对照组（NC）和Nrf2敲低组（siNrf2）,RT-qPCR和WB验证siRNA的转染效率。动物实验:采用高氧（FiO₂=80%）暴露构建BPD模型（生后12h-21d）,于7d龄行气管插管术,缓慢注入NC组或siNrf2组UC-MSCs（1×10⁶/40μL）或等体积的PBS溶剂进行移植治疗。SD新生大鼠分为常氧溶剂对照组（NOR+PBS）、常氧阴性对照治疗组（NOR+NC）、常氧敲低治疗组（NOR+siNrf2）、BPD模型组（BPD+PBS）、BPD阴性对照治疗组（BPD+NC）与BPD敲低治疗组（BPD+siNrf2）。于饲养过程中观察各组新生大鼠体格发育、活动量和离氧耐受等表现;统计生存率和体重变化（7d-21d）;在21d龄进行BALF和肺组织取材,计数BALF的细胞总数,H&E染色观察肺组织病理改变并测量MLI。结果:细胞实验:成功体外培养UC-MSCs并进行鉴定,UC-MSCs具有成骨成脂分化能力。RT-qPCR和WB检测发现siRNA处理后Nrf2的mRNA和蛋白表达降低（**P<0.01,***P<0.001）。动物实验:与所有常氧组相比较,高氧条件下的新生大鼠表现为体格发育迟缓,活动量减少,离氧不耐受,体重增长减缓。常氧组与高氧组相比,高氧组虽存在极少数新生大鼠死亡,但各组间生存率无统计学差异。统计7d到21d龄体重增长变化情况,高氧组较常氧组体重增长明显减缓（***P<0.001）;与（BPD+PBS）模型组比较,（BPD+NC）治疗组体重增长明显,具有统计学意义（*P<0.05）,（BPD+NC）与（BPD+siNrf2）治疗组体重增长无显著差异。（BPD+PBS）模型组较所有常氧组新生大鼠BALF中细胞总数明显增加（***P<0.001）,（BPD+NC）治疗组较（BPD+PBS）模型组BALF中细胞总数减少（*P<0.05）,而（BPD+siNrf2）治疗组较（BPD+NC）治疗组细胞总数明显增加（**P<0.01）。肺组织H&E染色可见常氧组肺泡结构完整,（BPD+PBS）模型组肺泡结构简化,（BPD+NC）及（BPD+siNrf2）治疗组较（BPD+PBS）模型组肺泡发育阻滞有不同程度的改善。进一步分析各组MLI值,结果为:（NOR+PBS）:（NOR+NC）:（NOR+siNrf2）:（BPD+PBS）:（BPD+NC）:（BPD+siNrf2）=49.86±1.605μm:46.46±1.605μm:49.12±2.157μm:100.5±3.033μm:56.98±1.793μm:84.12±2.076μm（***P<0.001）,（BPD+NC）治疗组较（BPD+siNrf2）治疗组的MLI值显著降低（***P<0.001）。结论:敲低Nrf2表达能减弱UC-MSCs对新生大鼠BPD的治疗效果。第二部分Nrf2对UC-MSCs的复制性衰老和免疫抑制能力的作用目的:探讨UC-MSCs的复制性衰老与Nrf2的相关性,以及复制性衰老是否影响UC-MSCs的免疫抑制能力,以进一步探究Nrf2在UC-MSCs的衰老表型和免疫抑制功能中的调控作用。方法:培养第5代（P5）和第18代（P18）的UC-MSCs,β-gal染色和HP-1γ免疫荧光检测衰老表型差异,CCK-8、Ki67免疫荧光以及流式细胞术周期检测细胞增殖能力的改变,WB检测衰老相关蛋白p16和Nrf2信号通路相关分子Nrf2、Ser40磷酸化的Nrf2（p S40-Nrf2）蛋白表达。在IFN-γ刺激条件下,RT-q PCR和WB检测P5和P18UC-MSCs中免疫抑制因子IDO-1的m RNA和蛋白水平表达的差异。流式细胞术检测早期和晚期代数UC-MSCs对PBMC增殖能力的抑制作用。si RNA转染UC-MSCs,分为NC组和si Nrf2组,β-gal染色检测3天后UC-MSCs中β-gal阳性细胞数的差异,Ki67免疫荧光和Ed U增殖检测下调Nrf2对UC-MSCs增殖能力的影响,CCK-8检测si RNA处理后NC组与si Nrf2组细胞7天内的生长曲线。然后,IFN-γ（10ng/m L）处理12h后,si RNA敲低Nrf2培养3天,分为阴性对照组Ⅰ（NC）和敲低组Ⅰ（si Nrf2）、IFN-γ阴性对照组Ⅱ（NC+IFN-γ）和IFN-γ敲低组Ⅱ（si Nrf2+IFN-γ）共4组,两两对应。RT-q PCR和WB检测Nrf2和IDO-1的表达。最后我们进行了PBMC增殖实验,分为PBMC对照组Ⅰ（PHA（-））、PBMC对照组Ⅱ（PHA（+））、共培养阴性对照组Ⅲ（NC+PHA（+））和共培养敲低组（si Nrf2+PHA（+））,显微镜下采集共培养图像,收集PBMC后流式细胞术检测PBMC的增殖情况。结果:与P5代数相比较,P18代数的UC-MSCs中衰老相关的β-gal染色阳性细胞数和异染色质蛋白1γ（HP-1γ）表达明显增加;CCK-8示P18代数UC-MSCs增殖能力下降（*P<0.05）,Ki67免疫荧光染色阳性细胞数减少（***P<0.001）,周期检测示G0/G1期细胞比例明显增加,S期和G2/M期比例下降;P18 UC-MSCs中p16蛋白表达增加,Nrf2和p S40-Nrf2蛋白表达减少（***P<0.001）。在不同浓度IFN-γ刺激下,与P5代数UC-MSCs相比,P18代数细胞IDO-1的m RNA表达显著降低（*P<0.05）,且在10ng/m L IFN-γ作用下,IDO-1的蛋白表达也显著降低（***P<0.001）;与P5代数UC-MSCs共培养的PBMC的增殖能力明显下降（*P<0.05）。siRNA敲低UC-MSCs的Nrf2表达,β-gal染色结果示siNrf2组UC-MSCs中β-gal阳性细胞数明显增加（***P<0.001）,Ki67免疫荧光检测示si Nrf2组Ki67阳性细胞比例下降（P**<0.01）,CCK-8检测结果显示第4天开始,si Nrf2组UC-MSCs增殖能力较NC组下降（**P<0.01）,Ed U增殖检测结果也表明si Nrf2组增殖能力明显下降（***P<0.001）。RT-q PCR检测结果显示,敲低组Ⅰ（si Nrf2）和IFN-γ敲低组Ⅱ（si Nrf2+IFN-γ）的Nrf2基因表达降低（***P<0.001）;在IFN-γ刺激条件下IDO-1的m RNA表达显著增加,与（NC+IFN-γ）组相比,（si Nrf2+IFN-γ）组的IDO-1的m RNA表达显著降低（**P<0.01）;WB检测结果示,Nrf2和IDO-1蛋白表达与m RNA表达水平一致。PBMC增殖实验,共培养图像和流式细胞术检测示PHA刺激活化PBMC成功,UC-MSCs能显著抑制PBMC的增殖,敲低Nrf2后的UC-MSCs对PBMC增殖的抑制作用减弱（**P<0.001）。结论:UC-MSCs体外扩增的过程中,复制性衰老伴随免疫抑制能力的降低,同时Nrf2表达降低。下调Nrf2表达加速UC-MSCs衰老,降低UC-MSCs的增殖能力和免疫抑制能力,可能通过调节IDO-1的表达实现。第三部分Nrf2激活剂ALA增强UC-MSCs的免疫抑制能力的作用研究目的:进一步探究转录因子Nrf2在UC-MSCs的衰老、增殖能力和免疫抑制功能中的调控作用。方法:Nrf2的激活剂α-硫辛酸（ALA）按50μmol/L、100μmol/L和150μmol/L浓度分别处理UC-MSCs,WB检测Nrf2蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖能力的差异,选择最佳药物浓度,分为对照组和ALA组,β-gal染色检测阳性细胞数差异。Nrf2的激活剂奥替普拉（OLP）处理UC-MSCs,WB筛选出合适的药物浓度,分为对照组和OLP组,CCK-8检测UC-MSCs生长曲线,Ki67免疫荧光染色检测细胞增殖能力。RT-q PCR检测ALA处理后UC-MSCs的IDO1表达水平的差异,流式细胞术检测ALA处理UC-MSCs后对PBMC增殖的影响。结果:不同浓度ALA分别处理UC-MSCs,Nrf2蛋白表达量随着ALA浓度的增加而增加（***P<0.001）;IFN-γ（10ng/m L）与ALA（100μmol/L）共同处理,UC-MSCs的Nrf2的表达量最高（***P<0.001）。ALA处理3天后,CCK-8检测示UC-MSCs在100μmol/L的浓度的ALA作用下增殖能力明显增强（**P<0.01）。选择100μmol/L为ALA最适浓度处理UC-MSCs。β-gal染色检测发现,ALA处理UC-MSCs 3天后β-gal染色阳性细胞明显减少（***P<0.001）。WB检测筛选出30μmol/L为最适OLP药物浓度,与对照组相比,CCK-8检测示OLP组细胞增殖能力增强（*P<0.05）,Ki67免疫荧光检测示OLP组的Ki67阳性细胞比例显著增加（***P<0.001）。ALA处理的UC-MSCs中IDO-1的m RNA表达明显增加（***P<0.001）,且体外抑制PBMC增殖的能力增强（**P<0.01）。结论:小分子化合物促进Nrf2表达,从而延缓细胞衰老并提高UC-MSCs增殖能力。UC-MSCs体外免疫抑制能力的增强,可能与Nrf2介导IDO-1的表达增加有关。