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第一部分:脐带间充质干细胞分离、培养以及HLA-G5表达的初步研究背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新和多向分化的潜能,并具有低免疫原性和免疫调节作用,能抑制同种异体免疫排斥反应,是一种较为理想的组织工程种子细胞,但具体的免疫调节机制尚未完全阐明。研究表明,MSCs可以低水平表达人白细胞抗原HLA-I类分子而不表达HLA-Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40或CD40L共刺激分子,因此MSC不能触发T细胞激活。HLA-G5是一种非经典的HLA-I类分子,具有多种免疫抑制功能,如NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞溶解,同种异体基因T细胞增殖,以及树突细胞成熟。鉴于HLA-G5和MSCs都具有免疫调节性质,本实验从人脐带中分离获取MSCs,观察脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是否表达HLA-G5,并研究其在MSCs介导免疫调节功能中的作用。目的从脐带中分离、培养间充质干细胞并予以鉴定,并研究HLA-G5在人脐带间充质干细胞中表达及其对T细胞体外的负性协同作用。方法采用双酶消化法分离脐带组织,进行贴壁分离和传代培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞表面标志的表达,并进行成脂、成骨诱导鉴定;采用蛋白质印记法(western blot)检测UC-MSCs中HLA-G5蛋白水平的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测重组人白细胞介素10(rhIL-10)干预后UC-MSCs培养上清中HLA-G5的含量变化;3H-TdR掺入法检测UC-MSCs对PHA刺激后的T细胞增殖的影响以及HLA-G5单克隆抗体部分阻断UC-MSCs抑制T细胞增殖的影响,ELISA法检测培养基上清液中细胞因子水平,以及HLA-G5单克隆抗体阻断作用后细胞因子水平的变化。结果(1)UC-MSCs贴壁生长,呈成纤维细胞形态,表达CD73、CD90、CD105,但不表达CD34、CD45、HLA-DR分子,在体外能向成脂肪细胞、成骨细胞方向诱导分化;(2)UC-MSCs表达37kDa的HLA-G5蛋白,且随着细胞传代,HLA-G5表达量下降;(3)rhIL-10干预后UC-MSCs培养基上清液中HLA-G5含量明显增高(P<0.05),并存在剂量依赖性;(4)UC-MSCs可抑制活化T细胞体外增殖,并调节IL-4、IFN-γ的分泌,使用HLA-G5mAb阻断后,抑制效果减弱。结论采用双酶消化法可以成功分离培养出UC-MSCs;UC-MSCs在体外具有抑制T细胞活化和增殖的作用,其表达的HLA-G5因子具有重要的免疫调节作用。第二部分:脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的疗效观察背景急性肝衰竭具有进展快,并发症多,治疗难度大,死亡率高,预后极差的特点,是当前肝脏疾病治疗的热点与难点,发病机制复杂,目前认为是由于机体免疫反应过强,短期内过强T细胞毒反应,迅速破坏大量肝细胞,引起大块状肝脏坏死。肝移植是治疗这种疾病的有效方法,但面临许多问题,如:供体缺乏、手术创伤大、排异反应、费用昂贵等,为此,迫切需要寻找治疗肝衰竭新方法。UC-MSCs可以在体内增殖、分化为肝细胞或肝样细胞,替代受损的肝细胞,促进肝功能恢复。目前,对于MSCs治疗肝衰竭作用机制的研究主要集中在MSCs的分化潜能方面,然而研究发现,MSCs在体外诱导分化为肝细胞需要7-14天,体内分化也需要4-5天,而MSCs在移植的早期未分化为肝细胞或肝样细胞时即显示出显著的疗效,用干细胞分化机制不足以解释MSCs移植的这种早期应答。那么MSCs对大鼠急性肝衰竭(Acute Liver Failure,ALF)早期作用机制如何?是本部分的研究重点。目的探讨UC-MSCs移植治疗对急性肝衰竭大鼠的肝功能、生存率和相关炎症细胞因子的影响,以及HLA-G5参与UC-MSCs免疫调节功能在治疗中的重要性。方法采用D-GAL联合LPS腹腔注射的方法制作大鼠肝衰竭模型;按第一部分的方法从脐带中分离培养出rhIL-10干预培养的UC-MSCs(HLA-G5高表达)及正常UC-MSCs,并利用CFSE进行标记;将两组细胞经尾静脉移植治疗大鼠肝功能衰竭模型各16只,并与模型对照组(n=16)进行比较,观察三组大鼠一般状况、生存率等情况,动态检测肝功能及肝脏病理变化,荧光显微镜下观察MSCs归巢至肝脏的情况,以及ELISA检测血浆中IL-4、IFN-γ含量变化。结果经CFSE标记的UC-MSCs染色后可见较强的绿色荧光,细胞标记率接近99%。造模后大鼠逐渐进入肝衰竭状态,表现为拒食,活动明显减少,萎靡、嗜睡或逐渐发展为昏迷状态,对外界刺激反应较迟钝,全身毛蓬松无光泽,尿失禁,尿色深黄;生化检查发现肝功能严重损害,组织学检查显示肝细胞大片坏死、大量炎性细胞浸润。从移植术后3d开始,实验组和移植对照组存活大鼠一般情况明显好于模型对照组;肝功能及肝脏组织学改善,实验组肝功能明显好于移植对照组。与正常大鼠比较,模型组血浆IFN-γ水平明显升高(P<0.05),而IL-4水平无明显差异(P>0.05),UC-MSCs治疗后,血浆IFN-γ水平明显降低,而IL-4水平明显升高,高表达HLA-G5的UC-MSCs治疗后IL-4变化更明显(P<0.05)。结论UC-MSCs经尾静脉移植治疗大鼠肝衰竭模型,能够促进大鼠肝功能修复,减轻肝脏组织的炎症反应,对急性肝功能衰竭具有明显治疗作用。UC-MSCs可利用免疫调节作用使促炎因子与抗炎因子达到新的平衡,且HLA-G5参与此过程,这可能是UC-MSCs移植治疗ALF的作用机制之一。