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二肽基肽酶Ⅲ(Dipeptidyl peptidase Ⅲ,DPPⅢ)是一种广泛存在于哺乳动物、植物、真菌和细菌中的Zn2+依赖型外切肽酶,能够选择性的从多肽链的N-末端切割二肽残基。来源于真核生物的DPPⅢ参与体内重要生物活性物质的新陈代谢,涉及炎症、疼痛调节、血压调节和癌症等病理生理过程,而细菌来源的DPPⅢ的相关研究较少。实验室前期通过糖原吸附的手段从珊瑚球菌属Corallococcus sp.EGB的胞外上清中分离纯化淀粉酶的同时,得到一个非糖苷水解酶。本论文通过肽指纹图谱鉴定并结合Corallococcus coralloides 2259基因组序列,PCR扩增得到了编码该酶的基因序列,序列全长1719 bp,编码572个氨基酸。序列比对及酶活测定发现该酶为DPPⅢ,归属于金属肽酶M49家族,但具有不同于该家族六肽保守区(HEXXGH)的五肽保守区(HEXXH),命名该酶为mDPPⅢ。由于其与已知功能性验证的其他DPPⅢ序列一致性较低(13-32%),且是首个来源于粘细菌的DPPⅢ,遂对其进行大肠杆菌外源表达,针对其酶学性质,蛋白结构和生理功能等方面进行了研究。通过蛋白表达纯化及分子筛层析确定mDPPⅢ为二聚体,分子量为117.7 kDa。酶学性质研究表明,该酶的最适酶反应温度为50℃,最适酶反应pH为7.0(Tris-HCl),该酶在30-70℃之间具有较好的稳定性。EDTA强烈抑制酶的活性,加入Zn2+,Co2+和Mn2+离子可以使酶活性恢复。加入0.1 mM的Mg2+,Mn2+,Co2+,Ba2+和Ca2+均能提高重组酶活性,但是Cu2+和Ni2+对重组酶的活性有抑制作用。以Arg-Arg-2-萘胺为底物时的 Am值为 773.06 μM,Vmax 为 0.89μmol·mim-·mg-1利用坐滴气相扩散法,经过结晶条件的初筛、复筛与优化,获得了 mDPPⅢ相关蛋白晶体的最适生长条件。Native-mDPPⅢ晶体结晶所需条件为0.1 M乙酸钠pH 4.59,23.5%w/v PEG 3350,蛋白浓度为 2.2 mg/ml,添加剂为 0.1%n-Octyl-β-D-glucode;Se-mDPPⅢ结晶所需条件为0.1 M乙酸钠pH4.59,24%w/v PEG 3350,蛋白浓度为 5.45 mg/ml,添加剂为 0.01 M TCEP hydrochioride。在 20℃,晶体生长一周后获得衍射分辨率达1.9 A的蛋白晶体,利用硒单波长异常散射成功解析了 mDPPⅢ的晶体结构。mDPPⅢ单体结构主要由28个α螺旋和13个β折叠组成。一条裂隙将其分为两个结构域,其中上端结构域(C端)主要由α螺旋组成,下端结构域(N端)含有由α螺旋围绕的5个β折叠构成的β折叠桶结构。两个单体分子之间主要通过下端结构域的相互作用形成二聚体,主要包括6个氢键和1个盐桥连接。Zn2+结合位点位于裂缝顶部的上端结构域,以四面体形式被His-384,His-388,Glu-417以及一分子水螯合,通过定点突变确认了它们在mDPPⅢ催化反应中的重要作用。结果表明mDPPⅢ的催化过程更接近于真核生物而不同于细菌来源的DPPⅢ。为了研究DPPⅢ在粘细菌中的生理功能,通过PCR扩增在mdppⅢ的N端延长978 bp的mdppⅢ-2序列,构建载体 pET-29a-attp-mdppⅢ-2 并电转至 Myxococcus xanthus DK1622,Western Blot检测表明mDPPⅢ在菌株DK1622中实现表达。与菌株DK1622相比,菌株DK1622-mdppⅢ-2在菌体分散性与产胞外多糖方面无明显差异,但其子实体发育过程有所提前,结果初步表明mDPPⅢ在粘细菌的子实体发育方面发挥着一定作用。此外,通过制备菌株DK1622-mdppⅢ和菌株DK1622的A信号分子并添加至DK1622菌悬液中,子实体发育分析显示它们对菌株DK1622的发育活动并无明显影响。mDPPⅢ是否通过肽酶活性降解细胞表面蛋白,增强A信号分子的产生,进而通过A信号途径影响粘细菌发育过程,还有待进一步验证。