慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是全球范围内呼吸系统疾病中发病率和死亡率居于前位的疾病，并且其发病还呈蔓延之势。明晰该病的病因和发病机理对于找到有效的预防和治疗对策是十分重要的。已知吸烟是导致COPD的主要病因，香烟烟雾(cigarettesmoke，CS)是一种富含氧化剂成份的复杂的混合物，在构成肺脏的多种细胞类型中，肺泡上皮细胞是遭受CS中氧化剂损伤的主要部位。Ⅰ型上皮细胞对氧化应激高度敏感，一旦损伤，就必须依赖于肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖才能得到补充。肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡上皮的干细胞，在受到氧化损伤以后，肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖启动速度的快慢对损伤的及时修复具有决定性作用。因此，有关香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract，CSE)对肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖的影响及其作用机理的研究就显得尤为重要。另外，包括视黄醇和维生素A酸(retinoicacid，RA)在内的类维生素A，曾被报道参与肺损伤的修复。然而，对于RA是否参与调节受CSE诱导的的肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖还从未被研究过。除了RA，还有一种可以作为合成谷胱甘肽前体的抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，虽已被用于COPD患者的治疗以减轻症状，阻止病情恶化和肺功能的加速下降，但其在逆转CSE所诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用机理仍需要进一步研究。 基于以上分析，本实验研究了CSE对人类肺泡Ⅱ型上皮细胞生长的影响，以及全反式维生素A酸(all-transretinoicacid，ATRA)和NAC对CSE的拮抗作用，并探讨了与此相关的分子机制。运用相差显微镜观察到CSE作用后细胞生长密度减低，漂浮细胞增多，尚贴壁细胞也呈回缩变圆的态势，细胞之间空隙加大，细胞折光性变弱，轮廓增强，且胞内颗粒状物质增多。通过MTT比色法检测，发现CSE对肺泡上皮细胞的这种生长抑制呈时间依赖性和剂量依赖性，且以流式细胞术手段证实受抑制细胞的生长是被阻止在了G1期。而ATRA和NAC则能拮抗CSE对肺泡上皮细胞的此种抑制作用。在以上变化的基础上，通过Hoechst33258染色以及透射电镜的手段还观察到了核浓缩，染色质凝集，边集，胞浆内空泡增多，细胞表面微绒毛消失等凋亡相关的形态学变化；经DNA琼脂糖凝胶电泳和AnnexinV-FITC/碘化丙锭双染法检测到了凋亡相关的生化特征，即DNA的片断化以及磷脂酰丝氨酸的外翻；并以流式细胞术进一步检测到了膜表面Fas受体的高表达以及在凋亡过程中发挥关键作用的caspase家族成员之一caspase-3的显著活化。从而证实CSE确能诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生凋亡。此外，在运用H2DCFDA染色后观察到细胞内反应性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)在细胞受到CSE刺激以后得到了快速而大量的积累，而ATRA和NAC能减低之。从而提示ROS在CSE所致肺泡Ⅱ细胞损伤过程中所发挥的关键作用。为了更深入的探讨CSE致损伤以及RA和NAC抗损伤的具体机制，本实验中还运用半定量和实时定量反转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)技术检测到单独使用CSE干预以及CSE联合ATRA干预以后肺泡上皮细胞内p21WAF1，转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-betal，TGF-β1)，胰岛素样生长因子结合蛋白-2(insulin-lkegrowthfactorbindingprotein-2，IGFBP-2)，以及cyclinEmRNA的表达在CSE单独作用组要明显高于联合作用组，p＜0.05。而对CDK2(cyclin-dependentkinase2，CDK2)mRNA的表达却又有着相反的影响；运用免疫印迹法和免疫组织化学法等手段检测到同转录水平相一致，p21WAF1，TGF-β1，IGFBP在蛋白水平的表达在CSE单独作用组也是明显高于联合作用组的，p＜0.05。但是，在CSE作用后，p53的表达在蛋白和核酸水平均未观察到有统计学意义的变化。另外，还发现NAC对受CSE诱导的肺泡上皮细胞中IGFBP-2的表达具有和RA相同但更为强大的调节作用。综上所述，从本实验中能够得出如下结论：CSE能抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞的生长且使其细胞周期阻滞于G1期；CSE能够诱导肺泡上皮细胞发生凋亡，且由Fas受体所介导的死亡受体途径参与此凋亡过程；CSE所引起的氧化应激可能是其抑制肺泡上皮细胞生长并诱导其凋亡的始动因素；TGF-β1，p21WAF1，和IGFBP-2可能参与介导了CSE所致肺泡Ⅱ型上皮细胞的生长抑制作用；CSE可能通过不依赖于p53的通路来上调p21WAF1的表达；ATRA可能通过对TGF-β信号通路的干涉而下调p21WAF1的表达，进而发挥其促增殖作用；ATRA和NAC对IGFBP-2的下调可能是其调节受CSE抑制的肺泡上皮细胞增殖的另一种机制。 第一部分香烟烟雾提取物对肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖周期的抑制作用及其与p21WAF1的关系 目的探讨香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)对人类肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞增殖周期的影响及其与p21WAF1的关系。方法通过相差显微镜观察CSE对细胞增殖状态的影响；MTT法测定细胞活力；流式细胞术检测细胞周期动力学变化；运用反转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)技术和免疫印迹法检测不同浓度CSE作用48小时后p21WAF1在mRNA和蛋白质水平的变化。结论CSE使肺泡Ⅱ型上皮细胞的生长被阻滞在其细胞周期的G1期，p21WAF1在细胞内的高表达可能是其导致肺泡Ⅱ上皮细胞增殖抑制的机制之一。 第二部分香烟烟雾提取物诱导肺泡Ⅱ型上皮来源的A549细胞通过Fas/APO-1参与的死亡受体途径而凋亡 目的研究香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract，CSE)对肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞的损伤作用并探讨与其相关的分子机制。方法运用MTT比色法检测CSE对细胞活力的影响；通过Hoechst33258染色以及透射电镜的手段观察形态学变化；以流式细胞术进行Fas受体表达和Caspase-3活性的测定；运用DNA琼脂糖凝胶电泳和AnnexinV-FITC/和碘化丙锭双染法从生化水平进行检测；以H2DCFDA染色来判断细胞内氧自由基的含量。结论本研究表明CSE能够抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞的生长和增殖，并诱导该细胞凋亡，由Fas受体所介导的死亡受体途径参与此凋亡过程。而CSE所引起的氧化应激则可能是阻止肺泡上皮细胞生长增殖并诱导其凋亡的始动因素。 第三部分维生素A酸对香烟烟雾提取物所致肺泡上皮细胞生长抑制的保护作用及其对细胞周期相关因子表达的调节作用 目的研究全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)对暴露于香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract，CSE)的肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖的影响及其调节机制。方法本实验选用来源于人类肺泡Ⅱ型上皮细胞的A549细胞株作为研究对象。以MTT比色法检测CSE和ATRA对A549细胞增殖的影响；运用半定量PCR和实时定量PCR的方法对细胞周期相关的转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-betal，TGF-β1)，p53，细胞周期素依赖性的激酶抑制剂(cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)p21WAF1，以及cyclinE和CDK2(cyclin-dependentkinase2，CDK2)在转录水平的变化进行了观察；对这些因子在蛋白水平的表达采用免疫印迹法，免疫组织化学法以及流式细胞术进行了检测。结论本研究证实RA能够拮抗受CSE诱导的肺泡Ⅱ上皮细胞的生长抑制作用；CSE可能通过不依赖于p53的通路来上调p21WAF1的表达；RA可能通过对TGF-β信号通路的干涉而下调p21WAF1的表达，再进一步发挥其促增殖作用。 第四部分维生素A酸和N-乙酰基-L-半胱氨酸对受香烟烟雾提取物抑制的肺泡上皮细胞中IGFBP-2表达的调节作用 目的研究全反式维生素A酸和N-乙酰-L-半胱氨酸对受香烟烟雾提取物刺激的肺泡Ⅱ型上皮细胞生长的调节作用及其与IGFBP-2的关系。方法运用MTT比色法测定细胞增殖活力；以荧光探针H2DCFDA负载以后利用流式细胞术观察细胞内反应性氧自由基水平(reactiveoxygenspecies，ROS)；以实时定量PCR，半定量PCR以及Westernblot的方法检测肺泡上皮细胞在受到香烟烟雾提取物，全反式维生素A酸和N-乙酰-L-半胱氨酸作用以后其IGFBP-2的表达在蛋白和核酸水平的变化。结论全反式维生素A酸和N-乙酰-L-半胱氨酸对IGFBP-2的下调可能是其调节受香烟烟雾提取物抑制的肺泡上皮细胞增殖的机制之一。