本实验室在前期对具有不同转移潜能的四个细胞株(MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6)的转录组和蛋白组进行了系统研究,筛选出了一系列的差异表达的基因。本论文对其中的两个差异表达基因AGR2和HDGF进行了研究。本论文的工作由两部分组成：AGR2基因促肝癌转移的研究和HDGF相互作用蛋白的鉴定。第一部分：AGR2基因促肝癌转移的研究肝癌的转移和复发是肝癌病人死亡的最主要原因,也是临床肝癌预防和治疗的最大挑战。肝癌的转移复发是一个多步骤形成、多基因参与并不断变化的过程,与肝癌转移复发相关的分子标记物和治疗靶标也是复杂多样的。因此找到与肝癌转移和侵袭相关的基因并发现其影响肝癌转移的机制,对于肝癌的预防和治疗将会具有重要意义。在前期的实验中,我们通过蛋白双向电泳(2DE)结合生物质谱技术,分析了相同遗传背景但转移潜能依次升高的四个肝癌细胞株(MHCC97、MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6)中的蛋白表达差异,发现AGR2 (anterior gradient homolog2)蛋白在高转移的HCCLM6显著高表达。尽管文献报道AGR2作为一个原癌基因,能够促进多种类型肿瘤的转移,但在肝癌中AGR2对其侵袭和转移的影响及分子机制尚未见报道。本章的主要贡献在于：发现AGR2是促肝癌转移的蛋白,在肝癌细胞系和组织中,AGR2的表达水平与肝癌转移程度显著相关；在体外,AGR2能够提高肝癌细胞的侵袭能力但不影响细胞的增殖能力和凋亡水平；AGR2能够促进HepG2细胞在裸鼠体内的肿瘤生长、肝内转移和肺转移；通过亲和纯化技术鉴定了AGR2的相互作用蛋白,发现其互作蛋白显著富集在凋亡和IMAPK相关通路中；进一步实验发现AGR2不影响肝癌细胞的凋亡,但能够增强细胞中ERK1/2的磷酸化水平,提示AGR2可能通过促进ERK1/2磷酸化进而增强细胞的侵袭和转移能力。本章的主要内容如下：1.AGR2的表达水平与肝癌转移能力呈显著相关。在具有不同转移潜能的四个细胞系中,AGR2蛋白的表达量随着细胞转移能力的提高而逐渐升高；在不转移的肝癌细胞系中AGR2蛋白的表达量显著低于具有转移能力的MHCC97L.肝癌组织样本的检测结果显示,AGR2 mRNA的表达量与肝癌的转移(P<0.001)和癌栓的形成(P=0.002)显著相关。2.体外实验研究显示AGR2能增强肝癌细胞的侵袭能力。在MHCC97H中干扰AGR2的表达后,细胞的侵袭能力下降40%。在MHCC97L和HepG2细胞中稳定过表达AGR2能够分别提高其侵袭能力30%和50%。但AGR2对肝癌细胞的体外增殖能力和凋亡水平没有显著影响。3.在裸鼠体内AGR2能够促进HepG2的肿瘤生长和转移。裸鼠皮下接种HepG2稳定株,AGR2稳定株具有更快的肿瘤生长速度。接种4周后,与对照组相比AGR2稳定株组的瘤重提高了50%。取HepG2稳定株的瘤块进行裸鼠肝脏原位接种,与对照组相比,AGR2稳定株的肝内转移发生率由12.5%提高到62.5%,而肺癌转移发生率由0提高到12.5%。4.鉴定到18个与AGR2相互作用的蛋白。我们利用串联亲和纯化(SBP/FLAG-TAP)结合质谱技术鉴定与AGR2发生相互作用的蛋白,通过三次平行实验,最终得到18个高可信度的相互作用蛋白质。用Co-IP先后验证了STK4、PDCD6、TAK1和TAB1四个蛋白与AGR2的相互作用。利用Ingenuity Pathways Analysis (IPA)对鉴定到的AGR2相互作用蛋白进行分析,发现互作蛋白在凋亡和MAPK信号通路中显著富集。5.AGR2促进ERK1/2的磷酸化,但不影响肝癌细胞的凋亡。尽管鉴定到的相互作用蛋白和凋亡通路密切相关,但是没有发现AGR2对MHCC97H. MHCC97L和HepG2细胞的凋亡产生显著影响。我们发现AGR2能够促进ERK1/2的磷酸化：在HEK 293T细胞中,AGR2能够提高TAK1和TAB1对SAPK/JNK和ERK1/2磷酸化的增强能力；在HepG2中,稳定转染AGR2能使ERK1/2的磷酸化水平升高。文献报道ERK1/2能够诱导蛋白酶的表达并降解细胞基质,促进迁移并提高转移过程中细胞的存活率等,因而我们推测AGR2可能通过促进ERK1/2的磷酸化进而影响转移。肿瘤转移是多步骤形成、多基因参与的过程,单个基因或蛋白不可能孤立地发挥作用。本章我们鉴定到了18个与AGR2发生相互作用的蛋白,AGR2可能通过与这些蛋白的协同合作,影响ERK1/2磷酸化,进而促进肝癌细胞在裸鼠体内的生长和转移。而AGR2在肝癌转移调控过程中的具体作用是什么；是作为上游的转移调控因子,还是下游具体的执行蛋白；是具有决定作用的枢纽蛋白,还是只起一定作用的功能性蛋白,目前还无法解答,有待于对其进行深入的探讨。第二部分：HDGF相互作用蛋白的鉴定HDGF (hepatoma-derived growth factor)肝癌衍生生长因子,参与多个组织器官的生长和发育,并在癌症的发生和发展中发挥着重要的作用。前期的实验中,我们发现在具有不同转移潜能的四个肝癌细胞株(MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6)中,HDGF蛋白的表达量随着转移潜力的增强而升高,而在HCCLM3和MHCC97H细胞中干扰HDGF的表达后,细胞的凋亡程度明显增加。但HDGF作用的分子机制和参与的细胞通路目前仍不明晰。本章的主要贡献在于：利用串联亲和纯化(SBP/FLAG-TAP)技术并结合质谱鉴定到132个HDGF的互作蛋白：采用基于SBP纯化的RNA共沉淀技术(SBP-RIP)提取并鉴定了HDGF复合体中的RNA；发现HATH结构域对于HDGF参与相互作用是必需的；通过对HDGF相互作用组的分析,发现HDGF可能还具有多种新功能,提示HDGF可能是个多功能蛋白,为进一步深入了解其作用机制奠定基础。本章的主要内容如下：1.利用SBP/FLAG标签进行亲和纯化的可行性研究。结果显示SBP/FLAG不影响HDGF的核定位,也不影响其与DNA或已知互作蛋白(C12orf11和C15orf44)的相互作用,表明SBP/FLAG标签可以用于HDGF相互作用的研究。我们进一步研究了两个标签的纯化条件和效果：在非交联条件下,SBP和FLAG标签的回收率分别为43%和52%；在甲醛交联的条件下,SBP和FLAG标签的回收率分别为40%和23%,甲醛交联显著降低FLAG纯化的回收率。因而后续实验选取非交联条件进行亲和纯化。2.鉴定HDGF的相互作用蛋白。利用SBP和FLAG串联亲和纯化技术(SBP/FLAG-TAP),纯化富集HDGF的复合体,经SDS-PAGE分离、银染、切胶、酶解后,LC-MS/MS鉴定蛋白。四次独立实验共鉴定到132个与HDGF互作的蛋白。3. HDGF与蛋白的相互作用依赖于HATH结构域。通过SBP/FLAG-TAP结合质谱对HDGF全长蛋白及其两个部分(HATH和NO-HATH)的互作蛋白分别进行了鉴定。发现了95个与HATH结构域相互作用的蛋白,其中88个曾在HDGF的互作蛋白中被鉴定到,而NO-HATH只鉴定到5个互作蛋白,表明HDGF与蛋白的相互作用主要依赖于HATH结构域。4. Co-IP和荧光共定位验证蛋白相互作用。通过Co-IP依次验证了Histone H2B、PAPR1、PRKDC7、DDX5、SFRS1、HDAC1和SSRP1七个蛋白与HDGF及其HATH结构域的相互作用；采用荧光共定位验证了DDX5、SFRS1、HDAC1和SSRP1四个蛋白与HDGF或其HATH结构域存在共定位。5.纯化并鉴定HDGF复合体中的RNA。通过SBP标签亲和纯化HDGF的复合体,Trizol提取其中的RNA,逆转录成双链DNA后,3’末端加A后连接到T载体上,测序发现HDGF复合体中RNA的组分主要是18S rRNA和28SrRNA,还包括PRELID1和SFSWAP的mRNA。6. HDGF复合体中RNA的存在依赖于HATH结构域。通过SBP-RIP分别提取了全长HDGF、HATH和NO-HATH复合体中的RNA,发现从全长HDGF和HATH结构域的复合体中提取的RNA电泳图基本一致,而NO-HATH和空载体对照组中没有明显的RNA。而后通过RT-PCR验证了18S rRNA、28S rRNA、PRELID1和SFSWAP的mRNA只存在于HDGF和HATH结构域的复合体中。7.对HDGF相互作用组的分析提示HDGF是个多功能蛋白。参与细胞的多种生理活动：其能通过影响染色质重塑以及与转录共激活或共抑制因子的相互作用调控转录；可能参与细胞核糖体的生物合成、RNA的编辑和剪接、以及DNA的损伤修复等细胞的多种生理活动。本章的研究中,我们分别通过SBP/FLAG-TAP结合质谱和SBP-RIP技术鉴定了HDGF的互作蛋白和RNA,通过分析发现HDGF是个多功能蛋白,参与细胞的多种生理活动,尽管HDGF的许多新功能尚需进一步的实验验证,但为进一步深入了解HDGF的功能和作用机制奠定了基础。