胃癌严重威胁着国人的生命健康。化放疗是当前晚期胃癌的重要治疗手段,肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药致使胃癌治疗失效是胃癌致死的重要因素。因此,多药耐药作为胃癌恶性生物学行为发展演进和治疗过程中的重要环节,是胃癌干预和治疗研究的关键所在,也是本实验室多年来致力研究的重要方向之一。MGr1是本实验室前期研究筛选得到的一株具有自主知识产权的与胃癌耐药密切相关的单克隆抗体,其抗原在胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达水平显著高于其亲本细胞系SGC7901,后续研究鉴定出MGr1识别的目标分子为37LRP。MGr1-Ag/37LRP可能参与了缺氧等多个胃癌耐药相关信号转导通路,通过调节P-gp、MRP、Bcl-2、Bax和FAK、PI3K等分子参与胃癌MDR。PrPC是本实验室前期研究发现的与胃癌多药耐药密切相关分子群的重要成员。研究发现PrPC在胃癌细胞系和组织中广泛表达,并在胃癌耐药细胞系中较亲本细胞系表达显著升高。PrPC可能同时参与了胃癌细胞系SGC7901中P-gp依赖和P-gp非依赖的耐药,经典MDR分子P-gp、凋亡相关基因Bcl-2和Bax以及PI3K/Akt是PrPC参与胃癌MDR的可能分子通路。PrPC同时被研究证实还参与了增殖、转移等多个胃癌恶性生物学表型。然而,PrPC作为一个GPI锚定分子,是如何将细胞外信号传递至细胞内从而引起胃癌细胞的一系列生物学效应的呢?国外同期研究报道37LRP通过介导病理型朊蛋白(PrPSc)在人肠上皮细胞的内吞促进疯牛病的感染。这两个蛋白又被我们发现同时在缺氧诱导的胃癌mdr中发挥作用,并经由相似的分子信号通路影响了胃癌的mdr表型。这引起了我们的极大兴趣,是否mgr1-ag/37lrp参与了prpc相关的胃癌mdr,他们在胃癌耐药中又有着怎样的联系?【研究目的】1.对mgr1杂交瘤细胞进行克隆化和鉴定并对mgr1小鼠腹水进行纯化和鉴定,检测mgr1对胃癌耐药细胞药物敏感性和细胞增殖的影响;2.研究mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌中的表达相关性、蛋白表达共定位及相互作用;3.研究胃癌细胞中prpc对mgr1-ag/37lrp是否具有调控作用及mgr1-ag/37lrp是否参与prpc介导的胃癌mdr;4.如果mgr1-ag/37lrp参与了prpc介导的胃癌mdr,初步探讨其可能的机制。【研究方法】1.mgr1的克隆化、纯化鉴定及对胃癌耐药细胞药物敏感性和细胞增殖的影响:有限稀释法对mgr1杂交瘤细胞进行克隆化,免疫细胞化学检测mgr1杂交瘤亚克隆细胞系分泌单抗的能力;将挑选出的mgr1杂交瘤亚克隆细胞系制备小鼠腹水,westernblot检测其抗体效价;利用辛酸-硫酸铵沉淀法、xmagtmproteing磁珠亲和法和rproteing亲和纯化法对小鼠腹水进行纯化,westernblot检测其抗体活性及效价;hoechst染色结合药敏实验,利用arrayscan®vti高内涵筛选分析仪检测mgr1纯化抗体对胃癌耐药细胞系sgc7901/vcr的5-fu药物敏感性的影响;利用arrayscan®vti高内涵筛选分析仪结合hoechst染色,检测mgr1纯化抗体对胃癌耐药细胞系sgc7901/vcr细胞增殖的影响。2.mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌中的表达相关性、表达共定位及相互作用:westernblot检测mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌细胞系sgc7901、sgc7901/vcr、mkn28和ags中的表达水平,分析其表达相关性;免疫组织化学染色检测mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌患者组织标本中的表达水平及相关性;免疫细胞荧光染色结合激光共聚焦检测mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌细胞系sgc7901、ags及胃癌患者组织标本中中的表达共定位;免疫共沉淀实验检测mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌细胞系sgc7901/vcr中的相互作用。3.mgr1-ag/37lrp是否参与prpc介导的胃癌mdr:westernblot检测mgr1-ag/37lrp在过表达和抑制表达prpc的胃癌稳定转染细胞系sgc7901/prp和sgc7901/prpi中的蛋白表达水平;sirna下调胃癌耐药细胞系sgc7901/vcr和过表达prpc的稳定转染胃癌细胞系sgc7901/prp中mgr1-ag/37lrp的表达,westernblot检测mgr1-ag/37lrpsirna的干扰效果;mtt法检测mgr1-ag/37lrpsirna和mgr1纯化抗体对sgc7901/vcr和sgc7901/prp细胞系药物敏感性的影响。4.mgr1-ag/37lrp参与prpc介导胃癌mdr的可能机制:adr蓄积潴留实验检测mgr1-ag/37lrpsirna对sgc7901/vcr和sgc7901/prp细胞系adr泵出率的影响;hoechst染色观察mgr1-ag/37lrpsirna对sgc7901/prp细胞系经vcr诱导后的细胞凋亡的影响;annexinⅤ/pi双染色结合流式细胞仪检测mgr1-ag/37lrpsirna对sgc7901/vcr和sgc7901/prp细胞系经vcr诱导后细胞凋亡率的影响;caspase3活性染色结合arrayscan®vti高内涵筛选分析仪检测mgr1-ag/37lrpsirna对sgc7901/prp细胞系经vcr诱导后caspase3活性的影响。westernblot检测mgr1-ag/37lrpsirna对sgc7901/prp细胞系经vcr诱导后akt/pakt表达的影响。【研究结果】1.mgr1的克隆化、纯化鉴定及对胃癌耐药细胞药物敏感性和细胞增殖的影响:经过克隆化和免疫细胞化学染色筛选,得到一株能高效分泌mgr1单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞亚系mgr1-5;用杂交瘤细胞亚系mgr1-5制备的小鼠腹水,westernblot可获得阳性目的条带,且抗体效价可达1:2000,xmagtmproteing磁珠亲和法和rproteing亲和纯化法均适用于mgr1小鼠腹水的纯化;采用hoechst染色结合药敏实验,利用arrayscan®vti高内涵筛选分析仪检测结果提示,终浓度为20μg/ml的mgr1纯化抗体可显著增加胃癌耐药细胞系sgc7901/vcr对5-fu的敏感性(p<0.05);利用arrayscan®vti高内涵筛选分析仪结合hoechst染色检测结果提示,终浓度为20μg/ml的mgr1组和2μg/ml的5-fu组均与阴性对照组之间具有统计学差异(p<0.05),且这两组之间没有统计学差异(p>0.05);但这两组与小鼠igg对照组间没有显著差异(p>0.05),小鼠igg对照组与阴性对照组之间也没有显著差异(p>0.05),因此尚不能认为mgr1可以直接影响sgc7901/vcr细胞的增殖;2.mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌中的表达相关性、表达共定位及相互作用:westernblot和灰度分析结果显示mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌细胞系sgc7901/vcr、sgc7901、ags和mkn28中表达趋势一致,并具有显著相关性(p<0.05);免疫组织化学染色检测提示,mgr1-ag/37lrp和prpc在同一患者的连续组织切片中呈现一致的表达模式,统计学分析结果显示所检测的50例样本中,mgr1-ag/37lrp和prpc的表达阳性率分别为52%和66%,二者的表达存在显著相关性(p<0.05,r=0.3786);免疫细胞荧光染色结合激光共聚焦检测结果显示,mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌细胞系中主要表达在细胞浆和细胞膜,在ags和sgc7901中均可见mgr1-ag/37lrp和prpc存在部分共定位;免疫组织荧光染色结合激光共聚焦显微镜扫描结果显示,mgr1-ag/37lrp和prpc在胃癌组织的腺体中存在共定位;免疫共沉淀实验结果显示,利用proteina/gagarose结合prpc的兔抗人多抗,可将sgc7901/vcr细胞中的prpc及mgr1-ag/37lrp共沉淀,提示mgr1-ag/37lrp及prpc在胃癌细胞中共同存在于一个蛋白复合体,可能存在相互作用。3.mgr1-ag/37lrp是否参与prpc介导的胃癌mdr:westernblot检测结果提示,mgr1-ag/37lrp在过表达prpc的胃癌稳定转染细胞系sgc7901/prp中的蛋白表达水平较转入空载体的对照细胞系明显增高,在抑制prpc表达的胃癌稳定转染细胞系sgc7901/prpi中较转入空载体的对照细胞系明显降低,提示prpc蛋白表达水平可能影响或调控mgr1-ag/37lrp蛋白的表达;用sirna下调胃癌细胞系中mgr1-ag/37lrp的表达,westernblot检测显示,转染mgr1-ag/37lrpsirna后的sgc7901/prp和sgc7901/vcr细胞中mgr1-ag/37lrp的蛋白表达量较转染阴性对照的细胞中显著减少(p<0.05),证明该sirna可以有效地抑制mgr1-ag/37lrp的蛋白表达;药敏实验结果显示,mgr1-ag/37lrpsirna可以显著增加sgc7901/prp和sgc7901/vcr细胞系对p-gp依赖的adr、vcr和vp-16以及p-gp非依赖的5-fu和cddp的药物敏感性(p<0.05);mgr1纯化抗体也可以显著增加sgc7901/prp对上述化疗药物的敏感性(p<0.05),提示mgr1-ag/37lrp可能通过p-gp相关和非相关的分子机制参与了prpc介导的胃癌mdr。4.mgr1-ag/37lrp参与prpc介导胃癌mdr的可能机制:adr蓄积潴留实验结果显示,瞬时转染mgr1-ag/37lrpsirna的sgc7901/vcr和sgc7901/prp细胞系较转染sirna阴性对照的细胞阿霉素泵出能力显著下降(p<0.05),提示mgr1-ag/37lrp可能通过影响胃癌细胞对化疗药物的摄取和泵出能力参与prpc介导的胃癌mdr;hoechst染色检测结果显示,经vcr诱导后瞬时转染mgr1-ag/37lrpsirna的sgc7901/prp细胞系较转染sirna阴性对照的细胞系凋亡细胞明显增多;AnnexinⅤ/PI双染色结合流式细胞术检测结果提示,瞬时转染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/VCR和SGC7901/PrP细胞系较转染siRNA阴性对照的细胞经VCR诱导后细胞凋亡率显著升高(p<0.05),提示MGr1-Ag/37LRP另一方面可能通过影响胃癌细胞对化疗药物诱导的凋亡抵抗参与了PrPC介导的胃癌MDR;Caspase3活性染色结合ArrayScan®VTI高内涵筛选分析仪检测结果显示,瞬时转染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/PrP细胞系较转染siRNA阴性对照的细胞经VCR诱导后caspase3活性显著增加,进一步证实抑制MGr1-Ag/37LRP的表达可以显著促进化疗药物诱导后SGC7901/PrP发生细胞凋亡。Western blot检测显示,瞬时转染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/PrP细胞系较转染siRNA阴性对照的细胞经VCR诱导后pAkt的表达水平显著降低,提示MGr1-Ag/37LRP可能通过调节PI3K/Akt通路影响了PrPC介导的胃癌MDR。【结论】MGr1-5是一株可以有效分泌MGr1的小鼠杂交瘤细胞亚系,xMagTM ProteinG磁珠亲和法和rProtein G亲和纯化法均适用于MGr1小鼠腹水的纯化。终浓度为20μg/ml的MGr1纯化抗体可显著增加胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR对5-FU的敏感性,尚不能认为MGr1可以直接影响SGC7901/VCR细胞的增殖。MGr1-Ag/37LRP与PrPC在胃癌细胞系和组织中具有良好的表达相关性和表达共定位,可能存在相互作用关系。MGr1-Ag/37LRP的蛋白表达水平受PrPC蛋白表达的调控,且参与了PrPC介导的胃癌MDR。MGr1-Ag/37LRP siRNA和MGr1纯化抗体(20μg/ml)可部分逆转PrPC介导的胃癌MDR表型。MGr1-Ag/37LRP可能同时参与了PrPC介导的胃癌细胞化疗药物泵出能力的提高和对化疗药物诱导的细胞凋亡的抵抗。其分子机制可能是MGr1-Ag/37LRP通过调节PI3K/Akt通路参与了PrPC介导的胃癌MDR。结合本实验室的前期研究结果,MGr1-Ag/37LRP可能是PrPC介导的胃癌MDR相关信号通路的重要调节分子,仍需要更多的分子机制研究和体内研究结果来证实我们的发现。本研究充实了MGr1-Ag/37LRP作为新的胃癌多药耐药干预靶点的研究基础,为深入理解胃癌细胞耐药的分子机制提供了有益的补充,同时也为临床逆转多药耐药提供新的思路。