真核生物的m RNA在翻译之前需要在细胞核中经过剪接加工过程,即前体m RNA在剪接小体的作用下,通过精确的移除内含子并拼接外显子而得到成熟的m RNA。这一过程作为重要的转录后调控机制,对于基因的差异表达、组织器官的发育调控以及正常生理功能的维持具有重要的生物学意义。因此,剪接功能的异常通常会引起严重的发育缺陷以及多种人类疾病的发生（如:颌面骨发育不良、小颅畸形、RP、再生障碍性贫血、多种肌营养不良症、癌症等）。PRPF31是一个在生物体各组织中广泛表达的组成型剪接因子,其在细胞内的主要功能是促进剪接复合体亚基U4/U6.U5 tri-sn RNP的组装与稳定。PRPF31突变是引起常染色体显性视网膜色素变性（autosomal dominant retinitis pigmentosa,ad RP）的主要因素之一,目前该基因已被报道的致病突变位点达到130多个,但迄今该基因突变引起RP的致病机制尚不明确。由于缺乏理想的动物模型,目前PRPF31基因的功能研究主要集中于细胞水平,其在生物体内发挥的剪接调控功能并不清楚。PRPF31在进化上高度保守,斑马鱼与人类的PRPF31蛋白具有83%的序列同源性。此外,斑马鱼在视网膜的发育、解剖结构以及感光功能方面与人类极为相似,作为眼科疾病的模式动物具有显著优势。因此,本研究中以斑马鱼为模型针对prpf31在视网膜发育中的功能及其突变引起RP的致病机制进行系列研究。原位杂交实验显示prpf31在视网膜整个早期发育过程中保持较高的表达水平,这表明Prpf31在视网膜的神经发生及功能的维持中发挥重要的作用。本文进一步利用CRISPR/Cas9技术成功获得了prpf31敲除的斑马鱼模型。组织学及免疫荧光分析显示prpf31突变导致感光细胞、内核层细胞、神经节细胞及穆勒胶质细胞分化减少,而多潜能的视网膜祖细胞（retinal progenitor cells,RPCs）则呈现出“积累”的状态。斑马鱼中过表达人源PRPF31显示野生型m RNA对突变体的表型有较好的回补效果,而致病突变p.Lys257fs*277的m RNA没有明显作用,突变型p.Arg372Glnfs*99则表现为明显的负显性效应。为寻找prpf31敲除引起视网膜分化缺陷的细胞学原因,本文通过TUNEL及AO实验检测到突变体视网膜中存在大量的细胞凋亡,同时伴随p53通路的激活。在prpf31突变体中同时敲除p53可以有效抑制RPCs细胞的凋亡,但对视网膜的分化没有明显回补效果。这一结果表明Prpf31缺失引起的RPCs凋亡是p53通路依赖的,且细胞凋亡更可能是RPCs分化异常的结果而非原因。EDU嵌入实验、实时动态观察、抗alpha-tubulin免疫荧光等实验对视网膜的细胞增殖、有丝分裂、纺锤丝的生成过程进行了检测。结果发现prpf31敲除引起的纺锤体组装的缺陷使RPCs发生细胞周期阻滞并停留在M期。进一步应用免疫荧光、彗星实验、WB等实验对DNA的完整性进行分析,发现prpf31突变导致早期（36 hpf）视网膜细胞发生DNA损伤,并伴随p53蛋白的表达增多。这些结果表明有丝分裂阻滞及DNA损伤引起的细胞凋亡是导致视网膜分化缺陷的细胞学基础。为揭示引起视网膜发育异常及细胞学缺陷的分子机制,本研究通过RNA-seq分析发现Prpf31缺失改变了一系列重要靶基因的剪接方式,这些基因主要参与有丝分裂以及DNA损伤修复过程。通过比较不同组织中突变体与野生型之间的剪接差异,发现Prpf31缺失对视网膜剪接的影响比其它组织更为显著。进一步的生物信息学分析及minigene实验发现这些显著差异剪接事件的相应外显子序列较短且5’端剪接位点强度较弱,因此对Prpf31具有更强的依赖性,在Prpf31不足的情况下更容易产生错误的剪接形式。综上所述,本研究利用prpf31敲除的斑马鱼模型首次发现该基因在视网膜发育和分化过程中发挥重要的生理功能,Prpf31通过影响DNA损伤修复及有丝分裂相关基因的剪接进而调控RPCs的增殖、分化和存活。PRPF31突变个体中这些重要生物学过程的改变很可能是引起RP的病理机制。本研究首次发现Prpf31在视网膜发育过程中的生理功能并阐明其分子机制,也为揭示PRPF31突变导致RP的病理机制提供了合理的推测。