【摘 要】
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α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）是一种糖苷水解酶,可以水解黄酮、皂苷、萜烯糖苷、甜菊醇类等天然糖苷的末端L-鼠李糖残基。近年来,由于α-L-鼠李糖苷酶在食品行业中具有如提高果汁质量、为酒类增香、制备甜味剂等,和在医药行业中如制备抗生素、制备生物活性物质等的重要应用价值,越来越受到人们的关注。虽然国内外已有商业化的产品问世,但是价格昂贵。目前α-L-鼠李糖苷酶的表达水平较低,同时,由于糖
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α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）是一种糖苷水解酶,可以水解黄酮、皂苷、萜烯糖苷、甜菊醇类等天然糖苷的末端L-鼠李糖残基。近年来,由于α-L-鼠李糖苷酶在食品行业中具有如提高果汁质量、为酒类增香、制备甜味剂等,和在医药行业中如制备抗生素、制备生物活性物质等的重要应用价值,越来越受到人们的关注。虽然国内外已有商业化的产品问世,但是价格昂贵。目前α-L-鼠李糖苷酶的表达水平较低,同时,由于糖苷类物质的大体积和低溶解度,影响了酶的催化效率,这严重阻碍了其在食品、医药等领域的应用。本文通过对α-L-鼠李糖苷酶的筛选、克隆和表达,显著提高了其发酵水平;基于结构对α-L-鼠李糖苷酶进行分子改造,改善其对芦丁底物的催化效率;通过对催化反应介质的研究,提高了α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的转化效率;最后通过使用磁性金属有机框架（MOF）材料对α-L-鼠李糖苷酶进行固定化研究,显著提高该酶的重复利用性。主要研究内容如下:（1）α-L-鼠李糖苷酶的筛选、克隆与高效表达:从自然界中筛选获得一株能够产α-L-鼠李糖苷酶的菌株Aspergillus niger CCTCC M 2018240。通过克隆获得了该α-L-鼠李糖苷酶（An Rha）基因rha,通过系统发育树分析,An Rha归属于GH 78家族,通过同源建模获得An Rha的三维结构,结构中含有GH 78家族酶典型的（α/α）6-桶状结构。以p PIC9K为表达质粒,实现了密码子优化基因optrha在毕赤酵母中的高效表达,重组菌株GS115/9K-optrha-98的酶活最高,为0.45 U/m L;酶学性质分析显示,重组An Rha最适温度为65℃,最适p H为5.0,65℃条件下孵育8 h,剩余53.08%的酶活,t1/2为9.67h,该酶能够水解二糖单位含有α-1,2和α-1,6糖苷键的天然糖苷;在5-L发酵罐中高密度发酵120.95 h后酶活为17.08 U/m L,是摇瓶酶活的37.96倍。（2）基于结构对An Rha进行分子改造提高其催化效率:通过同源建模获得An Rha的三维结构,对活性口袋的关键氨基酸残基进行突变,获得4个催化效率是WT 2倍以上的突变体L234A、L234C、F345S和L234A/S339V/F345S,以及一个热稳定性明显提高的突变体S339V。其中F345S的kcat/Km值为43.84 s-1m M-1,是WT(17.51 s-1m M-1)的2.5倍,最适温度为65℃,最适p H为5.0,在65℃保温8 h后,残余酶活为55.25%,t1/2为9.69 h;L234A的最适温度降为60℃,最适p H降为4.0,65℃保温10 min后残余酶活只剩46.4%,t1/2只有11.27 min。结构分析表明,F345S的活性口袋入口的增大,是提高催化效率的主要原因;MD模拟表明L234A底物结合口袋附近和催化残基附近的loop波动增大,从而提高了酶的催化效率,但是也降低了酶的热稳定性。F345S在5-L发酵罐进行高密度发酵190 h后,OD600为682,酶活为53.84 U/m L,是摇瓶水平的119.64倍。（3）α-L-鼠李糖苷酶在低共熔溶剂（DES）溶液中高效转化芦丁:合成24种DESs,在氯化胆碱和尿素合成的DES（Ch Cl-U）溶液中,An Rha转化芦丁效率最高。在40%Ch Cl-U溶液中,6 U/m L的An Rha在60 min内将130 g/L芦丁完全转化,而在缓冲溶液中,8 U/m L的An Rha转化130 g/L芦丁时的转化率为67.18%;6 U/m L突变体F345S酶转化130 g/L芦丁150 min后转化率为95.3%。在40%Ch Cl-U溶液中,F345S酶比WT酶转化效率略有提高。通过K2HPO4与40%Ch Cl-U溶液形成双水相体系提取L-鼠李糖并回用DES,L-鼠李糖的纯度为96.28%。Ch Cl-U溶液经过5次重复利用后,芦丁的平均转化率可达95.63%,制备的异槲皮素平均纯度为94.22%。（4）制备磁性MOF材料对α-L-鼠李糖苷酶进行固定化研究:合成磁性MOF材料并固定化An Rha,固定化酶Rha@MOF的酶活为25.09 U/g。通过SEM、TEM、FTIR、XRD和MS表征,证明磁性MOF载体成功合成。动力学参数表明,酶固定化后亲和力获得了提高,但是催化速度降低。1.2 U/m L的Rha@MOF在缓冲液中转化20 g/L芦丁时转化率为91.42%;获得的突变体固定化酶的酶活为32.3 U/g,酶终浓度1.2 U/m L时的最适底物浓度为30 g/L,转化率为94.9%,经过30次转化后,转化率为73.21%。
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