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研究背景和目的特发性扩张型心肌病（idiopathic dilated cardiomyopathy,IDCM）是一种以心室扩张和收缩功能受损为特征的结构性心脏病,对治疗反应差,病死率高。IDCM病因复杂,其中编码骨架蛋白基因突变在IDCM发病中起重要作用。LDB3（LIM domain binding 3）、PDLIM5、PDLIM3基因编码的骨架蛋白Cypher、ENH（Enigma homolog protein）、ALP（Actinin-associated LIM protein）同属于PDZ-LIM蛋白家族,通过PDZ结构域锚定在Z线,参与肌节间力的传递,也是细胞信号传导的热点。已有研究报道LDB3基因多态性与IDCM易感性存在一定的相关性,然而目前缺乏LDB3基因多态性在我国汉族人群中的研究,也未见LDB3基因上稀有突变与IDCM易感性及预后的研究。而关于PDLIM5与PDLIM3基因突变是否影响IDCM易感性及预后,尚未见相关报道。动物研究发现,Cypher、ENH、ALP敲除小鼠均出现扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）,但具体机制尚不清楚。文献报道凋亡、内质网应激、心肌纤维化等信号通路与IDCM发病密切相关。因此本研究的目的是明确LDB3、PDLIM5、PDLIM3基因突变（包括基因多态性和稀有突变）与我国汉族IDCM易感性、临床表型及预后的关系,探索Cypher和ENH缺陷是否通过影响相关信号通路致DCM发病。方法1)遗传学调查:纳入浙江大学医学院附属第一医院111例中国汉族IDCM患者,和137例正常对照组。收集研究对象临床基线资料和长期随访情况。成功随访IDCM患者60例,中位随访时间为32个月,将随访2年内发生全因死亡和因心衰首次住院作为终点事件。采用sanger一代测序技术检测研究对象LDB3、PDLIM5、PDLIM3基因上的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）和稀有突变。采用Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE）定律检测SNPs基因型分布情况。采用卡方检验分析各SNPs基因型和等位基因分布,以及单倍型对IDCM易感性的影响。采用t检验或非参数检验、卡方检验分析基因型与表型间的关系。用Kaplan-Meier法绘制随访2年内无全因死亡生存曲线,并通过log-rank法检验携带各SNPs位点不同基因型的IDCM患者间生存曲线差异。2)机制探索:为进一步探究LDB3基因编码蛋白Cypher参与DCM发病的具体机制,构建了Cypher敲低心肌细胞和Cypher敲除小鼠模型。用CCK-8实验检测Cypher敲低对心肌细胞活力的影响。用TUNEL染色检测Cypher敲低对心肌细胞和Cypher敲除对小鼠心肌凋亡的影响。用流式细胞术检测心肌细胞凋亡比例。用定量q PCR、western blotting检测Cypher敲低对Akt/p38 MAPK信号通路的影响,探索潜在作用机制。用CO-IP检测Cypher与Akt结合情况。为探究PDLIM5基因新剪接体ENH-203 W37X突变参与DCM发病的可能机制。对携带ENH-203 W37X的先证DCM患者进行家系调查。用定量q PCR检测ENH-203在组织间的表达差异。用免疫荧光检测ENH-203在细胞中的定位。构建ENH-203野生型和W37X突变过表达质粒和慢病毒。通过转录组测序分析ENH-203 W37X突变对相关基因m RNA表达影响。结果在基线水平,IDCM患者组较对照组心率更快,QRS波长更长。随访结果显示,2年内全因死亡IDCM患者组中房颤患者比例更高,2年内因心衰首次住院的IDCM患者收缩压和舒张压更低,心率更慢。1年随访期间IDCM患者左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）较基线显著提高,左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD）明显减小。1)基因多态性与IDCM易感性、临床表型及预后研究在LDB3基因中共检测到12个SNPs包括rs4256897、rs2675692、rs2803555、rs11812601、rs2803558、rs3740342、rs4468255、rs3740343、rs2248643、rs56165849、rs3740346、rs3740347,在PDLIM5基因中共检测到5个SNPs包括c.731+131 T＞G、rs7690296,rs2280003、rs10031423、c.1789-3 C＞T,在PDLIM3基因中共检测到6个SNPs包括rs4861669、rs4862543、rs2306705、rs10866276、rs12644280、rs4635850符合HWE平衡。IDCM易感性研究中,在rs11812601基因多态性中携带TT+GG基因型较GT型,rs3740342基因多态性中携带T等位基因较C等位基因,rs4468255基因多态性中携带G等位基因较A等位基因、GG基因型较GA+AA型、GA+GG型较AA型、GG型较AA型,rs3740347基因多态性中携带T等位基因较G等位基因、TT基因型较GT+GG型和GG型、GT+TT型较GG型,c.731+131 T＞G基因多态性中携带G等位基因较T等位基因、GT+GG基因型较TT型,rs7690296基因多态性中携带A等位基因较G等位基因,c.1789-3 C＞T基因多态性中,携带T等位基因较C等位基因、CT+TT基因型较CC型,rs4861669基因多态性中携带A等位基因较G等位基因、GA+AA基因型较GG型、AA型较GG型,rs4862543基因多态性中携带G等位基因较T等位基因、GT+GG基因型较TT型、GG型较GT+TT型和TT型人群,患IDCM风险增加。基因型与表型研究中,在rs4256897基因多态性中携带GG基因型较GA+AA型、在rs3740347基因多态性中携带GT+TT型较GG型IDCM患者,并发房颤风险增加。在rs4468255基因多态性中携带GG基因型较GA+AA型、在c.731+131 T＞G基因多态性中携带TG+GG基因型较TT型、在c.1789-3 C＞T基因多态性中携带CT+TT基因型较CC型、在rs7690296基因多态性中携带GA+GG基因型较AA型的IDCM患者,舒张压更低。男性IDCM患者在rs2675692基因多态性中携带AA基因型较AT+TT型、在rs2803555基因多态性中携带TT基因型较TC+CC型、在rs11812601基因多态性中携带GG基因型较GT+TT型、在rs2803558基因多态性中携带TT基因型较TC+CC型、在rs3740342基因多态性中携带CC基因型较CT+TT型增多。吸烟患者在rs2675692基因多态性中携带AA基因型较AT+TT型、在rs2803555基因多态性中携带TT基因型较TC+CC型、在rs2248643基因多态性中携带CC基因型较CG+GG型增多。在c.731+131 T＞G基因多态性中携带TG+GG基因型较TT型、在c.1789-3 C＞T基因多态性中携带CT+TT基因型较CC型的IDCM患者,收缩压更低,心率更慢。在rs4861669基因多态性中携带AA基因型较GA+GG型、rs4862543基因多态性中携带GG基因型较TG+TT型的IDCM患者,病程更长,血清钠离子浓度更低。在rs2306705基因多态性中携带GG基因型较AG+AA型的IDCM患者病程更长。在rs12644280基因多态性中携带CC基因型较CT+TT型的IDCM患者患左束支传导阻滞风险增加,心功能更差。在rs3740346基因多态性中,携带GC+CC基因型较GG型的IDCM患者较GG型年龄更大。在rs4468255基因多态性中携带AA型较GA+GG型的IDCM患者LVEDD更大。单倍型与易感性研究中,携带单倍型G-T-C-T-C-C（rs4256897-rs2675692-rs2803555-rs11812601-rs2803558-rs3740342）人群IDCM患病风险降低,而携带单倍型G-C-C-C和A-T-C-T（rs2306705-rs10866276-rs12644280-rs4635850）人群IDCM患病风险增加。基因型与预后研究中,rs2280003基因多态性中携带CC基因型较CT+TT型,rs10866276和rs4635850基因多态性中携带TT基因型较CT+CC型的IDCM患者,死亡风险增加,生存期明显缩短。2)稀有突变与IDCM相关性研究在16例IDCM患者中检测到15种LDB3基因上稀有突变,在15例IDCM患者中检测到12种PDLIM5基因上稀有突变,在6例IDCM患者中检测到8种PDLIM3基因上稀有突变。与不携带PDLIM3基因上稀有突变的IDCM患者及所有患者相比,携带稀有突变的患者并发左束支传导阻滞风险增加,心功能更差,表现为LVEF更低,LVEDD更大。3)Cypher蛋白缺陷致DCM发病机制研究Cypher敲低抑制心肌细胞活力,促进心肌细胞凋亡。Cypher敲除小鼠表现为心脏扩大,凋亡增加。Cypher敲低,促凋亡基因Bax、Bim、PUMA的m RNA水平显著上调,bcl-2/Bax比例明显下调;同时Bax、cleaved caspase3、p-p38促凋亡蛋白表达水平显著升高,p21蛋白水平和Erk、Akt-473蛋白磷酸化水平显著降低。Cypher可与Akt相互结合。用Akt刺激剂刺激Cypher敲低细胞后,Akt-473磷酸化水平上调的同时,Bax表达下降。4)DCM相关ENH-203 W37X突变研究在测序中发现PDLIM5基因新的剪接体ENH-203,其编码的蛋白质不含有PDZ及LIM结构域。并在一个DCM家系中发现ENH-203 W37X突变。检测ENH-203在组织和细胞中的表达发现,ENH-203在心脏和骨骼肌中高表达,并在细胞核中高表达。后续转录组测序提示ENH-203 W37X突变可显著上调Trib3 m RNA水平。结论1.LDB3基因上rs11812601、rs3740342、rs4468255和rs3740347多态性,PDLIM5基因上c.731+131 T＞G、rs7690296和c.1789-3 C＞T多态性,PDLIM3基因上rs4861669和rs4862543多态性与IDCM易感性相关。2.LDB3、PDLIM5和PDLIM3基因多态性,包括rs4256897、rs2675692、rs4468255、rs3740347、rs2803555、rs11812601、rs2803558、rs3740342、rs2248643、rs3740346、c.731+131 T G、rs7690296、c.1789-3 c T、rs4861669、rs4862543、rs2306705和rs12644280,影响IDCM患者的临床表型。3.PDLIM5基因上rs22800003多态性,PDLIM3基因上rs10866276和rs4635850多态性与IDCM患者预后相关。4.Cypher敲低通过抑制Akt/p38 MAPK信号通路诱导心肌细胞凋亡增加。5.PDLIM5基因新剪接体ENH-203上DCM相关W37X突变促进Trib3 m RNA表达。