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研究背景:膀胱癌（Bladder cancer,BC）是全球范围内十大最常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率、高复发率以及高死亡率的特点。根据肿瘤浸润深度,BC可分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer,MIBC）。虽然根治性膀胱切除术、全身化疗、靶向治疗和免疫治疗已经显著提高了BC的治疗效果,但由于高复发率和远处转移,患者总生存率仍不能令人满意。因此,探究并开发治疗BC的辅助性药物迫在眉睫。越来越多的证据表明天然化合物在治疗BC方面的潜力,穿心莲内酯（Andrographolide,Andro）是植物穿心莲中提取的二萜类内酯化合物。作为穿心莲的主要活性成分之一,它具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理学活性。然而,Andro在BC治疗中的应用及其潜在的分子机制有待进一步研究。方法:1.通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）筛选穿心莲的有效成分及其作用靶点。同时从Gene Cards,OMIM,Pharm Gkb,TTD,Drug Bank共5个数据库检索BC相关基因。然后,将穿心莲药物靶点与BC相关基因取交集,获得交集基因,并构建蛋白互作（Protein-Protein interaction,PPI）网络,进一步筛选出核心基因。并对交集基因进行GO生物过程及KEGG信号通路富集分析。最后,利用Vina软件进行模拟使化合物Andro与核心基因AKT以最低自由能结合并获得分子对接的结果。2.利用人膀胱癌细胞系（5637和T24）探究Andro单药治疗对膀胱癌细胞的作用及相关机制。体外实验利用了细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK8）实验、成克隆实验检测细胞增殖情况,流式细胞术（Annexin-V/PI双染法）检测细胞凋亡情况,细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力,JC-1染色测定线粒体膜电位,蛋白印迹（Western blotting）检测PI3K/AKT信号通路关键蛋白。体内实验构建皮下荷瘤（5637细胞）裸鼠模型,6只BALB/c裸鼠被随机分为2组,分别命名为对照组及Andro治疗组。在肿瘤生长过程中给予治疗并监测肿瘤体积,对小鼠实施安乐死后剥离肿瘤并称量重量。3.利用人膀胱癌细胞BIU87与BIU87顺铂耐药株（BIU87-Cis R）探究Andro联合顺铂（Cisplatin）对BIU87-Cis R细胞株的作用及潜在分子机制。体外实验部分涉及CCK8实验、成克隆实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Transwell实验、Western blotting以及免疫荧光染色等方法。体内实验部分构建皮下荷瘤（BIU87-Cis R细胞）小鼠模型,12只BALB/c裸鼠被随机分为4组,分别为对照组、Cisplatin治疗组、Andro治疗组以及Cisplatin+Andro治疗组,同样在肿瘤生长过程中给予对应治疗并监测肿瘤体积,对小鼠实施安乐死后剥离肿瘤并称量重量。结果:1.TCMSP数据库中符合筛选标准的穿心莲活性成分共24种,穿心莲相关靶基因共440个,符合筛选条件的有68个。从数据库Gene Cards,OMIM,Pharm Gkb,TTD,Drug Bank中得到8517个与膀胱癌有关的差异表达基因,取交集后得到58个基因。经过筛选后得到5个核心基因分别是:CDKN1A、TP53、JUN、ESR1及AKT1。选取穿心莲活性成分Andro与兴趣靶基因AKT进行分子对接,结果表明,Andro可以通过5个氢键与AKT蛋白结合口袋的LYS-276、LEU-295、SER-7、LYS-179、PHE-161氨基酸以最小自由能良好结合。2.体外实验表明,Andro预处理抑制了T24和5637细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导T24和5637细胞的内源性凋亡。并且,Andro预处理抑制了膀胱癌细胞核内p65的表达。Andro抑制T24和5637细胞中的p-AKT、p-PI3K和pm TOR水平,表明Andro通过抑制PI3K/AKT信号传导对膀胱癌细胞发挥抗肿瘤作用。体内实验结果表明,Andro治疗抑制了裸鼠皮下膀胱肿瘤的生长,且抑制了肿瘤组织中p-AKT和p65的表达。上述结果表明Andro通过在体外和体内抑制PI3K/AKT信号通路来抑制膀胱癌进展。3.与BIU87细胞相比,BIU87-Cis R细胞的E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达水平下调并伴有波形蛋白（vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达水平的上调。对于BIU87-Cis R细胞株,相较于Cisplatin或者Andro单独治疗,联合用药能显著抑制BIU87-Cis R细胞的增殖、迁移和侵袭。Andro治疗上调了BIU87-Cis R细胞E-cadherin的表达并下调了N-cadherin以及vimentin的表达,缓解了BIU87-Cis R细胞的上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）,这种效应在联合顺铂用药的情况下最为明显。同时,联合用药增强了Andro对BIU87-Cis R细胞内p-AKT、p-PI3K和p-m TOR的抑制作用。体内实验中,与Cisplatin单独用药相比,与Andro联合用药更能抑制顺铂耐药性膀胱肿瘤的增殖,且明显抑制了瘤组织内EMT相关蛋白及PI3K通路蛋白的表达。结论:通过网络药理学及分子对接研究我们猜测AKT基因可能是Andro治疗BC的靶基因。体内及体外实验表明,Andro通过调节PI3K/AKT信号通路抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭,诱导其通过线粒体内源途径凋亡,减轻顺铂耐药膀胱癌细胞的EMT从而对顺铂的治疗产生协同作用。本研究为临床应用Andro作为辅助性药物治疗BC提供了一定的理论依据。