目的:乳腺癌目前是威胁女性身心健康的最常见肿瘤,在欧美国家,每八名妇女一生中就会有一名罹患乳腺癌,每年在世界范围内诊断出的新发病例多达140万,其中中国患者可达近28万人。尽管随着手术、化疗、放疗、内分泌治疗等治疗方法提高、诊治水平提升,乳腺癌的5年生存率高达73%,但乳腺癌仍旧是导致女性死亡的主要原因,每年约有520,000人因此死亡,占所有癌症去世患者的20-30%。根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）表达情况可将乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型以及Basal-like型/三阴性乳腺癌。其中三阴性乳腺癌通常具有较高的组织学分级,恶性程度高,同激素受体阳性肿瘤相比更具侵袭性,复发、转移率高。因缺乏激素受体的表达及其侵袭性表型,使得化疗成为三阴性乳腺癌治疗的主要手段。虽然三阴性乳腺癌对化疗反应性较高,但持续缓解时间短。由于化疗效果不理想,迫切需要针对三阴性乳腺癌新的、有效的药物治疗方法。FEN1即袢状核酸内切酶1（Flap endonuclease-1）,是RAD2结构特异性核酸酶家族中的一员,具有多种酶切活性,可在DNA合成、细胞凋亡及DNA片段裂解的过程中发挥重要作用。多篇研究表报道肿瘤细胞在接受化疗或靶向治疗后,DNA修复系统得到加强,使得肿瘤细胞发生耐药,在DNA修复系统中起着关键作用的FEN1在应用DNA损伤剂后可上调。我们以往研究结果表明抑制FEN1的表达可增加HER2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀敏感性,同样有其他研究结果表明降低FEN1的表达可使得肺癌和胃癌细胞对顺铂敏感性增加。此外,我们另一篇研究结果发现FEN1蛋白在三阴性乳腺癌患者肿瘤组织中高表达,并且FEN1蛋白的高表达同三阴性乳腺癌患者的无远处转移生存期和总生存期缩短相关。所以深入研究FEN1是否可作为三阴性乳腺癌一个新的作用靶点,探寻新的治疗方法对三阴性乳腺癌的治疗具有积极意义。氧化应激指的是活性氧自由基（ROS）的产生同抗氧化防御系统之间的失衡。而细胞内氧化还原的失衡和氧化水平的增高是包括乳腺癌在内的肿瘤细胞的共同特点,但过高浓度的ROS则可导致细胞发生死亡。现有研究表明,多种化疗药物及靶向治疗药可使得肿瘤细胞内ROS升高,ROS过量引起氧化应激,从而导致细胞中蛋白质、脂质及DNA发生氧化损伤。修复ROS所致氧化性DNA损伤需要通过碱基切除修复通路（BER）相关蛋白募集至DNA损伤部位,进而修复相应损伤,现已证明FEN1作为碱基切除修复通路关键蛋白为骨肉瘤细胞修复氧化性损伤所必须,并且既往研究报道抑制FEN1磷酸化可使得裸鼠心肌细胞对氧适应性降低,但FEN1是否参与到三阴性乳腺癌细胞抗氧化应激过程中尚不清楚。所以为明确FEN1是否参与到三阴性乳腺癌ROS调节过程中,我们首先选择了三氧化二砷这一在其他肿瘤中明确可诱导ROS生成、且对于三阴性乳腺癌具有潜在应用价值的中药作为阳性诱导剂,并对其作用于三阴性乳腺癌进行研究。三氧化二砷初次应用于肿瘤治疗是上世纪70年代,对于急性早幼粒细胞白血病患者（APL）的治疗,可诱导早幼粒细胞分化及凋亡。近年来,多项研究表明在包括肝细胞癌、肺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤中三氧化二砷具有潜在的抗癌活性,可诱导细胞内ROS增加以及细胞凋亡和DNA损伤。并且在肝癌患者已进行相关临床实验,三氧化二砷联合肝动脉栓塞术可更有效抑制肿瘤。但因包括肝毒性、神经毒性、肾毒性、心脏毒性和致皮肤病等在内的副作用限制了三氧化二砷的临床应用,解决此问题的关键在于降低三氧化二砷用药剂量的同时保持抗肿瘤效力。榄香烯系中药莪术提取物,为辽宁省自主研发的抗癌药物,对肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤具有抑癌作用,并可增强多种化疗药物的疗效、逆转耐药及降低放化疗毒副反应,同样对三阴性乳腺癌具有潜在应用价值。既往研究报道表明榄香烯可诱导骨肉瘤及宫颈癌细胞内ROS升高,所以接下来第二部分我们研究了FEN1在榄香烯诱导三阴性乳腺癌氧化性损伤中的作用,以及抑制FEN1表达后联合应用榄香烯对三阴性乳腺癌增殖抑制的作用机制研究。为研究FEN1是否参与到三阴性乳腺癌细胞内ROS调节的过程中,我们选择了三氧化二砷和榄香烯两种可诱导肿瘤细胞ROS增加的中药作为阳性诱导剂,同时为探索三阴性乳腺癌新的作用靶点以及新方法,我们研究了FEN1在三氧化二砷和榄香烯两种中药诱导的氧化应激中的作用,以及抑制FEN1表达后分别联合应用三氧化二砷和榄香烯对三阴性乳腺癌增殖抑制的作用机制研究。论文中两部分实验给药剂量远低于三氧化二砷和榄香烯作用于三阴性乳腺癌细胞的IC50,以期在保证两种药物抗肿瘤效力的同时降低药物使用剂量,减少药物相关副反应,为FEN1抑制剂联合三氧化二砷或榄香烯应用于三阴性乳腺癌提供理论及实验依据。材料与方法:1.利用MTT法测定细胞增殖能力,并计算药物IC 50。2.利用Invitrogen?H2DCFDA分子探针检测细胞内ROS。3.利用eBioscienceTMAnnexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡。4.利用ACTIVE MOTIFTM试剂盒提取细胞核蛋白。5.利用Western Blotting检测BAX、BCL-2、PARP、γH2AX、FEN1、p-P38、P38、p-JNK、JNK、NRF2、LAMIN A/C、p-AKT、AKT、p-MET、MET、p-ERK、ERK、ACTIN。6.利用免疫荧光技术检测γH2AX蛋白表达情况。7.利用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染FEN1的siRNA转染。8.动物实验建立裸鼠乳腺癌原位成瘤模型,研究抑制FEN1表达联合三氧化二砷或榄香烯对乳腺癌原位成瘤病灶的抑制作用。9.利用Invitrogen?Green CMFDA试剂检测细胞内GSH量。10.利用BATMAN-TCM数据库提取榄香烯相关作用靶点。利用STRING 10.5数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。利用webGestalt数据库进行GO注释和通路分析。11.统计学处理:每次实验结果重复3次,数据以均值±标准差（±S）表示。采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。各组间比较采用t检验,P<0.05具有统计学意义。结果:1.三氧化二砷以时间-剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞生长。给予MDA-MB-231和MDA-MB-468两个三阴性乳腺癌细胞系三氧化二砷作用24和48h后应用MTT方法检测细胞的存活率。结果显示随着给药剂量的增加和药物作用时间的延长细胞存活率下降,由此我们可以知道三氧化二砷以时间-剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞生长。2.低浓度三氧化二砷通过诱导ROS增加导致细胞凋亡及DNA损伤。给予MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株递增浓度的三氧化二砷作用48小时后ROS的生成逐渐增加,在给予ROS抑制剂NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸）预处理后ROS生成被明显抑制。在相同的处理条件下,三阴性乳腺癌中细胞的凋亡程度同样随着三氧化二砷给药浓度的增加而显著增加,以晚期凋亡增加为主,并且凋亡程度同样可被NAC所逆转。结果表明三氧化二砷引起的三阴性乳腺癌凋亡由细胞内ROS的增加导致。同样MDA-MB-231细胞株在给予递增浓度的三氧化二砷后,BAX及PARP-cleaved表达逐渐增加,BCL-2表达降低。有证据表明ROS可以诱导氧化性DNA损伤。作为DNA损伤标志物,给予MDA-MB-231细胞株三氧化二砷后,随着药物作用时间的增加γH2AX表达增加。3.低浓度三氧化二砷诱导细胞FEN1表达上调,沉默FEN1联合应用三氧化二砷在体内及体外均显著抑制肿瘤生长。多项研究表明,DNA损伤可导致FEN1表达增加,因此,为研究三氧化二砷在三阴性乳腺癌细胞中引起的DNA损伤是否可诱导FEN1表达,在给予MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株三氧化二砷后,随着药物作用时间的增加FEN1表达逐渐增高。MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞沉默FEN1后再给予不同浓度三氧化二砷应用MTT实验检测细胞存活百分比,结果显示瞬时沉默FEN1后联合三氧化二砷可使得MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞增殖进一步被抑制。上述结果表明沉默FEN1联合低浓度三氧化二砷可有效抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。体内实验同样证明抑制FEN1表达可使三氧化二砷达到更好抑制肿瘤的效果。将MDA-MB-231细胞注射入裸鼠乳垫,建立裸鼠荷瘤模型后,将裸鼠随机分组,给予每组裸鼠腹腔注射不同药物（Control组:PBS 100μL/只;C20组:10mg/kg体重;ATO:2mg/kg体重;联合应用组:C20+ATO）,结果表明单独给予FEN1抑制剂C20及三氧化二砷均有一定的抑制肿瘤生长的效果,三氧化二砷抑制肿瘤生长效果大于C20,C20及三氧化二砷联合应用组肿瘤抑制率最高。并且将各组瘤体取出单独称重后同样可发现对照组瘤体重量最重,接下来依次为单用C20组、ATO组及C20+ATO组。由上述结果可知,抑制FEN1表达联合应用三氧化二砷可使得裸鼠乳腺原位成瘤瘤体得到有效抑制。4.沉默FEN1进一步增加低浓度三氧化二砷诱导的ROS升高及其导致的细胞凋亡坏死。MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞瞬时转染FEN1-siRNA及NC-siRNA后给予递增浓度的三氧化二砷。给予相同浓度三氧化二砷处理后,FEN1-siRNA组较NC-siRNA组产生更多的ROS,上述现象可被NAC逆转。并且在相同的处理条件及分组下,应用流式检测细胞凋亡,给予同等三氧化二砷浓度处理的FEN1-siRNA组细胞凋亡率明显高于NC-siRNA组,凋亡改变的趋势同ROS改变的水平相一致,凋亡的增加同样可被NAC逆转。5.沉默FEN1增加低浓度三氧化二砷诱导的ROS升高从而激活P38/JNK通路,促进细胞凋亡。在给予MDA-MB-231细胞不同处理（Control、ATO 5μM、NC-siRNA、FEN1-siRNA、FEN1-siRNA+ATO、FEN1-siRNA+ATO+NAC 10mM）后行Western Blot,实验结果表明BAX/BCL-2比值及γH2AX的表达在FEN1-siRNA+ATO组比ATO组进一步增加,应用NAC可逆转。在给予MDA-MB-231细胞前述同样处理后检测P38和JNK及其磷酸化蛋白的表达程度,实验结果表明沉默FEN1对P38及JNK的磷酸化表达程度无明显影响,给予三氧化二砷能使P38和JNK磷酸化表达水平增加,并且在抑制FEN1表达后给予三氧化二砷,P38和JNK磷酸化表达水平进一步增加,且同样可被NAC逆转。将沉默FEN1的MDA-MB-231细胞分别给予P38抑制剂SB203580 5μM及JNK抑制剂SP600125 10μM预处理后给予三氧化二砷,BAX/BCL-2比值及PARP-Cleaved表达程度均降低,凋亡被抑制。上述结果表明,抑制FEN1表达可使三阴性乳腺癌细胞在接受三氧化二砷处理后ROS生成进一步增加,并且可使P38和JNK的磷酸化表达水平升高,进而导致细胞凋亡程度增加。6.沉默FEN1增加低浓度三氧化二砷对Nrf2核移位的抑制,继而降低细胞内GSH水平。MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞分别瞬时转染FEN1-siRNA或NC-siRNA后给予递增浓度三氧化二砷加或不加NAC预处理,应用流式细胞术检测细胞内GSH量的改变。实验结果表明在两种细胞中无论在NC-siRNA还是FEN1-siRNA组中随着三氧化二砷给药浓度的增加细胞内GSH量逐渐降低,并且在给予相同浓度三氧化二砷情况下FEN1-siRNA组GSH下降更为明显,在加入NAC预处理后,细胞内GSH含量得到一定的恢复。MDA-MB-231细胞在沉默FEN1或给予三氧化二砷后细胞内Nrf2蛋白表达增加,应用siRNA沉默FEN1后给予三氧化二砷细胞内Nrf2的表达进一步增加。在给予MDA-MB-231细胞不同处理（Control、ATO 5μM、NC-siRNA、FEN1-siRNA、FEN1-siRNA+ATO、FEN1-siRNA+ATO+NAC10mM）后提取细胞核蛋白行Western Blot检测Nrf2,FEN1-siRNA+ATO组Nrf2核移位较单独应用三氧化二砷组及FEN1-siRNA组明显减少,然而给予NAC预处理后Nrf2核移位减少程度并未被逆转。7.榄香烯以时间-剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞生长。给予三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞榄香烯作用24和48h后应用MTT方法检测细胞的存活率。结果显示随着给药剂量的增加和作用时间的延长细胞存活率逐渐下降,由此可知榄香烯以时间-剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞生长。8.榄香烯诱导细胞凋亡,同时伴有MET及MAPK/ERK通路抑制和细胞DNA损伤。榄香烯诱导三阴性乳腺癌细胞发生凋亡,给予MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株递增浓度榄香烯,流式细胞术检测细胞凋亡程度同样随着给药浓度的增加而递增,并且以晚期凋亡增加为主。应用Western Blot进行验证:BAX/BCL-2比值降低,Caspase 3裂解带增加。给予递增浓度榄香烯或同浓度榄香烯作用时间逐渐延长后,MET及ERK磷酸化程度被逐渐抑制。分别给予MDA-MB-231细胞递增浓度榄香烯或同浓度榄香烯作用时间逐渐延长后,Western Blot结果表示γH2AX表达明显增加,上述结果表明榄香烯可诱导三阴性乳腺癌细胞发生DNA损伤。9.榄香烯诱导FEN1表达上调,沉默FEN1联合应用榄香烯在体内、体外均显著抑制肿瘤细胞生长。给予MDA-MB-231细胞递增浓度榄香烯后,FEN1表达逐渐增加。MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞沉默FEN1后再给予不同浓度榄香烯,应用MTT实验检测细胞存活百分比,结果显示瞬时沉默FEN1可增加三阴性乳腺癌细胞对榄香烯的敏感性,表明抑制FEN1表达联合应用榄香烯可更有效抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。体内实验同样证明抑制FEN1表达可使榄香烯具有更强抑制肿瘤的效果。将MDA-MB-231细胞注射入裸鼠乳垫,建立裸鼠荷瘤模型后,将成瘤裸鼠随机分组,给予每组裸鼠腹腔注射不同药物（Control组:PBS 100μL/只;C20组:10mg/kg体重;榄香烯:25mg/kg体重;联合应用组:C20+ATO）,结果表明单独给予FEN1抑制剂C20及榄香烯均可抑制肿瘤生长,C20及榄香烯联合应用组肿瘤抑制率最高,瘤体体积最小。将各组瘤体取出单独称重后发现对照组瘤体最重,接下来依次为单用C20组、榄香烯组及C20+榄香烯组。10.沉默FEN1增加榄香烯诱导的ROS升高及其导致的细胞凋亡坏死。给予MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞递增浓度榄香烯后,ROS的生成逐渐增加,在给予ROS抑制剂NAC预处理后ROS生成被明显抑制,应用siRNA沉默FEN1后给予同样浓度梯度榄香烯,在同等榄香烯作用浓度下ROS生成进一步增加,且同样可被NAC抑制。在相同的处理条件下,应用流式检测细胞凋亡,给予相同浓度榄香烯处理的FEN1-si RNA组细胞凋亡率明显高于NC-siRNA组,凋亡改变的趋势同ROS变化水平相一致,凋亡的增加同样可被NAC逆转。11.沉默FEN1进一步增加榄香烯诱导的生存通路抑制和DNA损伤。MDA-MB-231细胞接受不同处理因素后（Control、榄香烯20μg/ml、NC-siRNA、FEN1-siRNA、FEN1-siRNA+榄香烯、FEN1-siRNA+榄香烯+NAC 5mM）行Western Blot,BAX/BCL-2比值、Caspase 3裂解带的增加及γH2AX表达在FEN1-siRNA+榄香烯组比单用榄香烯组进一步上调,应用NAC可逆转。p-ERK及p-MET表达在给予单用榄香烯及单独FEN1组均有一定程度的降低,在FEN1-siRNA+榄香烯组二者进一步降低,但给与NAC并不能改变其表达程度。12.生物信息学分析结果表明榄香烯作用于谷胱甘肽代谢通路影响肿瘤细胞抗氧化能力。利用BATMAN-TCM数据库提取出30个β-榄香烯作用的靶点,并将上述30个靶点基因利用STRING 10.5数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析,得到406个与靶基因相互作用的蛋白。然后利用webGestalt数据库,对β-榄香烯互作蛋白网络的交集靶点进行GO注释和通路分析。分析结果表明榄香烯可影响细胞部分抗氧化分子活性,并且可作用于GSH代谢通路。结论:1.三氧化二砷以时间-剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。2.三氧化二砷抑制三阴性乳腺癌细胞增殖是通过诱导细胞发生凋亡及DNA损伤。3.三阴性乳腺癌细胞中三氧化二砷通过诱导氧化应激的发生而介导凋亡产生。4.三阴性乳腺癌细胞中,沉默FEN1联合应用三氧化二砷能使细胞内ROS生成进一步增加,从而发挥更为有效的抑制细胞增殖的作用。5.沉默FEN1联合应用三氧化二砷使ROS生成增加而提高P38、JNK磷酸化水平及DNA损伤水平进而有效抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。6.沉默FEN1联合应用三氧化二砷可通过减少Nrf2核移位使得细胞内GSH降低。7.榄香烯以时间-剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。8.榄香烯诱导细胞凋亡,同时伴有MET及MAPK/ERK通路抑制和细胞DNA损伤。9.三阴性乳腺癌细胞中榄香烯通过导致氧化应激的增加而介导凋亡产生。10.三阴性乳腺癌细胞中,沉默FEN1联合应用榄香烯能使细胞内ROS生成进一步增加,从而促进对细胞的抑制。11.沉默FEN1进一步增加榄香烯诱导的生存通路抑制和DNA损伤。12.生物信息学分析提示榄香烯可作用于GSH代谢通路影响三阴性乳腺癌细胞抗氧化能力。