目的:甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,近年来在世界范围内其发病率显著上升,约占女性恶性肿瘤的5-10%。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer,PTC）是甲状腺癌最常见的病理亚型,约占甲状腺癌的85%-90%。尽管大多数的PTC病人可以通过手术切除后进行甲状腺素抑制结合放射性碘治疗获得良好的预后,仍有部分晚期进展型PTC病人因广泛的侵袭转移,导致肿瘤复发和癌症相关死亡率显著增加。因此,研究PTC发生发展的分子机制,对发现有效的诊断和治疗新方法至关重要。Bcl-2相关永生基因（Bcl-2-associated athanogene,BAG）是近年发现的抗凋亡基因家族。BAG蛋白家族C末端均存在保守的BAG结构域,能与热休克蛋白HSP70/HCP70相互作用,产生广泛的细胞生物学效应,包括细胞凋亡、肿瘤发生、神经分化、应激反应和细胞周期等,因此BAG家族蛋白也被公认为是共分子伴侣（Co-chaperone）。BAG5是其中唯一含有多个BAG结构域的家族成员。近年来其相关研究主要集中于神经系统退行性疾病帕金森病方面,仅少数报道证实BAG5在一些人类肿瘤中过表达且与预后不良相关,其与甲状腺癌关系尚未见报道。本实验前期研究发现BAG5在PTC癌组织中蛋白表达显著增加,其具体原因及机制有待阐明。纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）家族与上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition,EMT）密切相关。EMT在肿瘤侵袭转移过程中扮演着重要角色,如上皮标记物E-cadherin表达降低,间充质标记物N-cadherin和FN表达增加等都是EMT最重要的特征。纤维连接蛋白1（Fibronectin 1,FN1）是FN家族重要成员,在包括甲状腺癌在内的多种人类癌症中被上调,有文献证实FN1能够促进PTC的侵袭和转移。本实验前期通过SILAC质谱分析在BAG5敲低的PTC细胞系中筛选出FN1蛋白存在显著差异,因此我们推测FN1可能是BAG5的下游靶分子,BAG5可能通过调控FN1发挥其在PTC中的作用,需进一步验证并解析其调控机制。本文旨在研究验证BAG5在PTC癌组织及癌旁组织中的蛋白表达差异及其在PTC细胞系中所发挥的功能。论证BAG5通过调控FN1发挥其在PTC细胞中促进迁移侵袭的作用,并进一步解释BAG5在翻译水平调控FN1的具体机制。研究方法:1、收集2018年3月-2018年5月中国医科大学附属第一医院甲状腺外科手术切除的84对PTC癌组织及配对的癌旁组织,Western blot及特异性免疫组化染色检测BAG5蛋白表达情况。2、培养PTC细胞系TPC1、K1、BCPAP、IHH4,Western blot检测各细胞系BAG5蛋白基础表达情况。3、慢病毒感染构建稳定过表达BAG5的TPC1、K1细胞系以及稳定敲低BAG5的BCPAP、IHH4细胞系,Western blot验证稳转效率。4、细胞计数实验、平板克隆实验检测BAG5各稳转细胞系细胞增殖能力;Transwell实验检测迁移和侵袭能力。5、利用SILAC质谱分析在BAG5稳定敲低的IHH4细胞系和对照组中进行差异蛋白筛选。6、Western blot检测BAG5各稳转细胞系中FN1表达情况,qRT-PCR检测BAG5各稳转细胞系FN1的m RNA水平,Western blot及特异性免疫组化染色检测组织中FN1蛋白表达情况。7、构建FN1真核表达载体转染BAG5稳定敲低的IHH4和BCPAP细胞系及各自对照组,Western blot验证转染效率,Transwell实验验证过表达FN1能够显著减弱BAG5敲低对PTC细胞迁移和侵袭的抑制作用。8、慢病毒感染敲低BAG5稳定过表达的TPC1和K1细胞系及各自对照组中FN1表达,Western blot验证稳转效率,Transwell实验验证敲低FN1能够显著减弱BAG5过表达对细胞迁移和侵袭的促进作用。9、Co-IP验证BAG5和FN1之间是否存在直接相互作用。10、加入溶酶体抑制剂E64D/pepstin A或蛋白酶体抑制剂MG132,分析FN1蛋白降解情况。加入环己酰亚胺阻断蛋白质的合成,Western blot分析FN1蛋白稳定性。11、多聚核糖体分析检测BAG5敲低的IHH4和BCPAP细胞系中FN1的mRNA在核糖体的分布情况。12、荧光素酶活性检测BAG5过表达细胞系TPC1及敲低细胞系IHH4中FN1的3’UTR荧光素酶活性。13、RNA序列分析筛选出存在显著差异的miRNAs,Targetscan、PITA、mi Rmap、microT和miRanda数据库预测筛选最有可能与FN1的3’UTR结合的miRNA。14、qRT-PCR检测BAG5各细胞系miR-144-3p表达情况。选取IHH4细胞系,构建野生型（Wt）FN1 3’UTR或潜在miR-144-3p结合位点突变体的FN1 3’UTR报告基因,荧光素酶活性检测mi R-144-3p antagomir和miR-144-3p mimic处理后的荧光素酶活力。15、miR-144-3p antagomir或miR-144-3p mimic处理BAG5各细胞系,Westernblot验证FN1表达,Transwell实验检测对PTC细胞侵袭的影响。16、统计分析利用Pearson相关检验84例PTC癌组织中BAG5和FN1蛋白表达的相关性。结果:1、84对PTC癌组织和配对癌旁组织中,BAG5蛋白在癌组织中的表达显著增加。2、过表达或敲低BAG5对于PTC细胞的增殖和克隆形成没有明显的影响。3、过表达BAG5显著促进PTC细胞的迁移和侵袭,而敲低BAG5则相反。4、SILAC质谱分析筛选出差异蛋白FN1,过表达或敲低BAG5基因的细胞系中FN1蛋白表达存在显著差异。5、FN1蛋白在PTC癌组织中的表达同样显著增加,且BAG5和FN1的蛋白表达呈正相关。6、过表达或敲低FN1能显著逆转BAG5对PTC细胞系迁移和侵袭的作用。7、BAG5在蛋白水平上调控FN1表达,但Co-IP证实二者无直接相互作用。8、BAG5并不影响FN1蛋白在PTC细胞系中的降解途径和稳定性。9、多聚核糖体图谱分析提示敲低BAG5能影响FN1的mRNA在核糖体的分布。10、荧光素酶活性检测提示过表达或敲低BAG5影响FN1的3’UTR荧光素酶活性,RNA序列分析筛选出存在显著差异的miR-144-3p,Targetscan、PITA、miRmap、microT和miRanda数据库预测FN1的3’UTR可能是miR-144-3p的潜在靶点。11、miR-144-3p antagomir显著增加BAG5敲低细胞系的侵袭能力及FN1蛋白表达,而miR-144-3p mimic显著降低BAG5过表达细胞系的侵袭能力及FN1蛋白表达。结论:BAG5在PTC癌组织中高表达,促进PTC细胞迁移侵袭。BAG5在翻译水平通过miR-144-3p上调FN1进而发挥其在PTC细胞中促进迁移侵袭的作用。