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目的:结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤。转移在结直肠癌中较常见。大约20%的结直肠在初次诊断时已经发生远处转移。大约60%诊断为进展期结直肠癌的患者预测会在5年内发生远处转移。虽然手术和药物治疗的进步,但在过去的几十年里治愈率和长期生存率并没有明显改变。早期结肠癌患者的5年生存率可达80-90%,进展期降为40-60%,如果同时存在转移癌,患者5年生存率仅5-10%。所以进展期结直肠癌的低生存率和高比例放化疗抵抗推动了结直肠癌新药物治疗靶点和治疗方法的研究。Cathelicidin（人基因CAMP,人蛋白LL-37,鼠基因camp,鼠蛋白mCRAMP）是一种抗菌肽,对于炎症性肠病、艰难梭菌感染和肥胖有治疗作用。近期有研究表明Cathelicidin参与了恶性肿瘤的发生发展。在结肠癌、胃癌、肝癌和口腔鳞状细胞癌中LL-37的表达低于正常组织,说明LL-37可能参与了抗肿瘤作用。研究表明Cathelicidin和它的类似物FK-16在人结肠癌HCT116细胞中诱导p53依赖的凋亡。其他类似物（FF/CAP18和Ceragenin CSA13）体外实验发现并没有依赖p53机制抑制HCT116增殖。我们既往研究还发现Cathelicidin没有直接抑制结肠癌HT29细胞的活性,而是通过抑制EMT抑制肿瘤相关的成纤维细胞,并破坏细胞骨架结构,减少了结肠癌细胞的增殖。Cathelicidin的生物学功能受其受体调节。Cathelicidin的作用受体包括至少4个G蛋白偶联受体、3个受体酪氨酸激酶、1个配体门控离子通道和Toll样受体。研究表明FPRL1受体和P2RX7受体可以直接与Cathelicidin作用。转移的结肠癌细胞通常具有间充质特性,比如像βIII微球蛋白表达。微管是细胞骨架的主要成分,由α和β微球蛋白组成的二聚体结构聚合而成,β微球蛋白以多种同型异构体存在于不同的组织。TUBB3是肿瘤细胞抗凋亡、增强侵袭邻近组织和转移能力的促存活级联分子通路的重要成分。TUBB3过表达与肿瘤侵袭性、对化疗药物耐药和不良预后有关。基于以上研究说明Cathelicidin是结肠癌的潜在治疗靶点。然而,Cathelicidin对于结肠癌转移的研究还没有报道。故本研究选取人结肠癌细胞系SW620、HT29及结肠癌肝肺转移裸鼠模型,采用MTS和Body Chamber、RT-PCR、tubulin tracker等方法证实Cathelicidin通过其受体破坏结肠癌细胞骨架,从而降低结肠癌转移。研究方法:1.选取人结肠癌细胞系SW620,予不同浓度的LL-37（1μM,5μM,10μM）及对照组处理。采用MTS和Body Chamber Approach方法评价LL-37对结肠癌细胞活力、迁移及侵袭能力的影响。2.建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型,经鼠尾静脉注射cathelicidin过表达的腺病毒,利用免疫组化、RT-PCR检测HA-AAV和mCRAMP在肝、肺的表达,证明造模成功。利用免疫组化、RT-PCR检测Cytokeratin18和Keratin20在肝、肺的表达,评价Cathelicidin是否可以抑制结肠癌转移。3.选取人结肠癌细胞系HT-29和SW620,予不同浓度的LL-37（1μM,5μM,10μM）及对照组处理。利用tubulin tracker染色和RT-PCR评价LL-37对TUBB3表达水平的影响。4.选取人结肠癌细胞系SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,分别转染TUBB3过表达及对照组慢病毒,采用Boyden chamber和RT-PCR评价LL-37是否通过减少TUBB3抑制结肠癌细胞迁移。5.利用PCR Arrays检测正常人肠组织及各期结肠癌患者癌组织中CAMP m RNA、P2RX7 mRNA和FPRL1 mRNA的表达。6.选取人结肠癌细胞系HT-29和SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,再分别予以P2RX7和FPRL1的拮抗剂KN62、WRW4及对照处理,采用Boyden chamber、RT-PCR和tubulin tracker染色探索LL-37通过P2RX7或FPRL1中的哪个受体抑制结肠癌细胞迁移。7.建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型,经鼠尾静脉注射cathelicidin过表达的腺病毒,再分别予以P2RX7的拮抗剂KN62及对照组处理,利用免疫组化、RT-PCR检测Cytokeratin18和Keratin20在肝、肺的表达,评价Cathelicidin是否通过P2RX7受体抑制结肠癌转移。8.选取人结肠癌细胞系SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,再分别转染P2RX7 shRNA及对照组,应用miRNA Arrays筛选相关microRNA,并分别再选取人结肠癌细胞系HT-29和SW620,应用RT-PCR方法进行验证。9.选取人结肠癌细胞系SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,再分别予miR200c-3p抑制剂及对照组处理,应用RT-PCR、Boyden chamber和tubulin tracker染色,评价LL-37是否通过miR200c-3p调节TUBB3的表达,抑制结肠癌细胞迁移。结果:1.LL-37在5μM和10μM时抑制结肠癌细胞SW620迁移,但不影响其活力及侵袭性。2.将人结肠癌细胞系HT-29（1*106/L）于100ul HBSS溶液制备细胞混悬液,8周龄裸鼠尾部静脉注入注射相同细胞数的人结肠癌细胞系HT-29,建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型。将裸鼠分2组,同天于鼠尾静脉分别注入HA-AAV和CAMP-HA-AAV(每100μL含4×1012基因拷贝数),第28天处死裸鼠,取肝、肺组织。CAMP-HA-AAV组肝、肺组织的CAMP mRNA表达明显高于对照组。两组HA-Tag染色基本一致,说明AAV载量基本相同。裸鼠的肝、肺组织均可见细胞角蛋白18表达阳性,CAMP-HA-AAV组肝、肺组织的细胞角蛋白18表达较对照组明显减少,且角蛋白20 mRNA水平明显降低。3.通过tubulin tracker染色可见LL-37在5μM和10μM时破坏结肠癌细胞骨架,并呈剂量依赖性。LL-37未影响TUBB1 mRNA水平在SW620和HT-29细胞的表达水平,LL-37在5μM明显抑制了TUBB3在SW620和HT-29细胞的表达水平。4.转染TUBB3过表达慢病毒组TUBB3 mRNA表达水平明显增加,无论是否暴露于LL-37转染TUBB3过表达慢病毒组明显增加了SW620细胞迁移性。5.Ⅱ期结肠癌组织表达Cathelicidin较正常肠组织中表达明显降低,其他各期组织间无明显差异。正常肠组织及各期结肠癌组织中均可见P2RX7 mRNA和FPRL1mRNA的表达,各组间表达无差异。6.P2RX7的拮抗剂KN62逆转了LL-37对SW620细胞迁移的抑制,但FPRL1的拮抗剂WRW4并不能逆转这种抑制,KN62还能减轻LL-37对SW620细胞骨架的破坏。瞬时转染P2RX7 shRNA明显减少P2RX7 mRNA,转染P2RX7 shRNA组可以使LL-37（5μM）降低的TUBB3mRNA表达水平再次升高。同样,P2RX7的拮抗剂KN62也可以阻止LL-37介导的TUBB3 mRNA表达水平的抑制。7.建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型。将裸鼠分2组,同样方法于鼠尾静脉分别注入HA-AAV和CAMP-HA-AAV,每组再各分2组,同样方法于鼠尾静脉分别注入P2RX7的拮抗剂KN62及对照组。KN62逆转了Cathelicidin过表达组肝、肺组织的细胞角蛋白18和角蛋白20的减少,且KN62逆转了Cathelicidin过表达组肝、肺组织TUBB3mRNA的表达下降。8.LL-37可以增加miR200c-3p在SW620和HT-29细胞的表达。转染P2RX7 shRNA可以逆转LL-37介导的miR200c-3p增加。同样,KN62也可以抑制LL-37诱导miR200c-3p的表达。miR200c-3p抑制剂逆转LL-37介导的TUBB3的抑制,细胞骨架的破坏及细胞迁移。结论:1.Cathelicidin呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞SW620迁移。2.Cathelicidin抑制结肠癌细胞转移。3.Cathelicidin抑制TUBB3 m RNA表达,破坏细胞骨架结构,抑制结肠癌细胞迁移及转移。4.Cathelicidin在正常人肠组织及各期结肠癌患者癌组织中均有表达,Ⅱ期结肠癌患者癌组织中Cathelicidin表达明显下降。5.P2RX7和FPRL1受体在正常人肠组织及各期结肠癌患者癌组织中均有表达,但各组间无明显差异。6.P2RX7的拮抗剂KN62,而不是FPRL1的拮抗剂WRW4逆转LL-37对结肠癌细胞迁移及TUBB3 mRNA表达的抑制作用。7.Cathelicidin通过P2RX7受体抑制结肠癌细胞转移8.Cathelicidin通过P2RX7受体增加miRNA200c-3p表达9.Cathelicidin通过miRNA200c-3p抑制微管蛋白表达,抑制结肠癌细胞迁移