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前言:骨肉瘤（osteosarcoma）是原发性恶性骨肿瘤中最常见的类型,在全世界的发病率大概是1-3/百万。骨肉瘤主要的临床症状为逐渐加重的持续性的局部疼痛,可伴有包块、肢体活动障碍,皮温升高,夜间痛尤甚,低生存率和疼痛使患者背负着极大的痛苦和生存压力。骨肉瘤主要的发病人群为青少年,但在50岁以上人群中有一个二次峰值。骨肉瘤是由恶性成骨细胞产生未成熟骨或骨样组织,可在组织学上分为:传统型或经典型、低级的中央型、骨膜型、骨膜旁型、毛细血管扩张型、小细胞型和成软骨细胞型。目前临床治疗骨肉瘤的主要方法是手术切除联合新辅助化疗。然而,单纯手术的患者5年生存率大概在15-17%。手术切除联合新辅助化疗（阿霉素、顺铂、加或不加甲氨蝶呤）,这样治疗方案的进步可以使5年生存率达到70%左右。但是,转移或复发的骨肉瘤患者的生存率仍约20%左右。免疫治疗在骨肉瘤的治疗中发挥着重要的作用,因为骨细胞与免疫系统细胞之间存在着重要的交叉和桥梁,开创了骨免疫学的跨学科新领域。许多信号传导通路RANK-RANKL system,IL?1,IL?6,IL?17和transforming growth factor?β（TGFβ）等在骨系统和免疫系统中均发挥着重要的作用。许多免疫系统基因敲除小鼠均改变了骨表型,例如Tnfsf11（编码RANKL）,interferon（αandβ）receptor 1（Ifnar1）,nuclear factor-κB（Nfkb）和interferon?γ（Ifng）等等。深刻理解骨肉瘤细胞、破骨细胞、骨细胞、成骨细胞与免疫细胞怎样驱动肿瘤的发生与进展仍旧处于初期的论证中。单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1（monocyte chemotactic protein induced protein 1,MCPIP1）是一种Cys-Cys-Cys-His型锌指蛋白,由zc3h12a基因编码。MCPIP1最初被发现在人外周血单核细胞并被单核细胞趋化蛋白（MCP-1）所诱导。MCPIP1能够在巨噬细胞中依靠促炎因子TNF,IL1b和LPS刺激下所诱导。MCPIP1具有RNase活性,通过与3’非翻译区（UTR）结合降解mRNA从而抑制促炎细胞因子（IL-1、IL-6和IL-12）的表达。此外,MCPIP1可以作为T细胞激活的制动因子,被认为是参与炎症平衡和控制的关键负调控因子。MCPIP1还参与细胞因子诱导的内皮炎症的控制和内皮功能障碍。近期,MCPIP1被证明可以通过抑制细胞凋亡参与乳腺癌的疾病进展。MicroRNAs（miRNAs）是一类调节基因表达的非编码核糖核酸,受表观遗传和遗传等机制调控。许多文献报道miRNAs调控骨肉瘤细胞或肿瘤组织的生长和转移,包括miR?133b,miR?100,miR?340或miR?214等。mi RNAs不仅调控许多生物学功能,诸如细胞发育、增殖、凋亡、分化和代谢,还广泛调控胶质母细胞瘤、尤因肉瘤、膀胱癌、结肠癌和骨肉瘤,更在许多癌症的耐药机制中发挥重要的作用。许多miRNAs可以通过调控目标蛋白来影响骨肉瘤细胞或肿瘤组织的生长和转移。本研究我们通过筛选一些感兴趣的microRNAs,发现miR-421在骨肉瘤患者组织中的表达差异,并探究了MCPIP1在骨肉瘤的疾病进程中发挥的作用;进一步探索在骨肉瘤组织中MCPIP1与miRNAs表达是否有相关性;是否与骨肉瘤的疾病进展相关;并进一步证实miR-421是否在骨肉瘤细胞和动物模型中可以调控MCPIP1靶点。材料和方法:一、实验材料1.组织标本收集我们收集2011年7月至2013年7月在中国医科大学附属医院及直属肿瘤医院住院患者手术切除的30例骨肉瘤标本组织,骨肉瘤旁的正常骨组织作为对照组。所收集的骨肉瘤患者中,在手术前均没有进行新辅助化疗。根据美国癌症联合委员会（AJCC）骨肿瘤分期系统TNM分期将患者的疾病进展分类。所有收集患者组织标本的实验都得到了中国医科大学伦理委员会的审查和批准,并取得了患者的知情同意及允许。2、细胞系:人骨肉瘤细胞系MG63和U2OS细胞培养购买于ATCC（American Type Culture Collection）。细胞解冻、传代、培养及转染按照ATCC细胞培养说明进行。3、实验动物6周龄BALB/c nude裸鼠（Balb/c-nu/nu）购买于Charles River公司,裸鼠饲养及相关实验严格按照动物福利法要求进行。所有动物实验都得到了中国医科大学伦理委员会的审查和批准,均符合中华人民共和国关于动物保护的伦理要求。二、主要研究方法1、通过real-time PCR检测30个骨肉瘤患者肉瘤组织和癌旁正常骨组织中的miR-15b,miR-133b,miR-140-5p,miR-25-3p,miR-129,miR-300,miR-421,miR-422,miR-421,miR-449,miR-542等诸多miRNAs的表达水平。分析他们的表达差异性。2、进一步使用Kaplan-Meier生存分析来评估miR-421的表达水平是否与骨肉瘤患者的预后生存时间存在联系,并使用卡方检验miR-421的表达水平是否与骨肉瘤的临床病理TNM分期存在关联性。3、通过real-time PCR检测30个骨肉瘤患者肉瘤组织和癌旁正常骨组织中的中的MCPIP1的mRNA的表达。分析他们的表达差异性。4、进一步使用Kaplan-Meier生存分析来评估MCPIP1 mRNA的表达水平是否与骨肉瘤患者的预后生存时间存在联系,并使用卡方检验MCPIP1 mRNA的表达水平是否与骨肉瘤的临床病理TNM分期存在关联性。5、将miR-421 control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421 inhibitor抑制剂分别转染到骨肉瘤MG63和U2OS细胞后,通过MTT比色法实验检测各组在12h（12小时）,24h（24小时）,36h（36小时）和48h（48小时）OD490nm吸光值,评估miR-421对于骨肉瘤细胞增殖的影响。6、将miR-421 control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421 inhibitor抑制剂分别转染到骨肉瘤MG63和U2OS细胞后,通过Western blotting和real-time PCR实验检测各组增殖相关因子cyclin D1和抑制凋亡相关因子bcl-2的蛋白水平和mRNA表达,评估miR-421对于骨肉瘤细胞增殖和凋亡相关因子的影响。7、通过transwell小室内突破实验检测各组骨肉瘤细胞迁移数量的改变,评估miR-421对于骨肉瘤细胞迁移的影响;检测各组迁移相关因子MMP2的蛋白水平和mRNA表达,评估miR-421对于骨肉瘤细胞迁移相关因子的影响。8、通过ELISA,Western blotting和real-time PCR实验检测各组促炎因子IL-6的蛋白水平和mRNA表达,评估miR-421对于骨肉瘤细胞释放促炎因子IL-6的影响。9、生物信息学miRDB软件预测MCPIP1是否与miR-421有共同的3?-UTR靶点。10、Control,miR-421和miR-421 antisense分别转染到带有pMIR-REPORTTMM vector（MCPIP1突变型）或带有pMIR-REPORTTMM vector control（MCPIP1野生型）的骨肉瘤MG63和U2OS细胞中,通过Dual luciferase reporter assay荧光素酶实验具体分析miR-421是否能够在骨肉瘤细胞中直接作用于MCPIP1的3?-UTR靶点。11、将miR-421 control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421 inhibitor抑制剂分别转染到骨肉瘤MG63和U2OS细胞后,通过Western blotting和real-time PCR实验验证miR-421是否可以调控体外骨肉瘤MG63细胞和U2OS细胞中MCPIP1蛋白水平和mRNA表达差异。12、将Control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421mimic+MCPIP1蛋白分别转染到骨肉瘤MG63细胞中,通过MTT比色法实验检测各组在12h（12小时）,24h（24小时）,36h（36小时）和48h（48小时）OD490nm吸光值,并检测各组cyclin D1和bcl-2的蛋白水平和mRNA表达,最后评估miR-421是否能通过调控MCPIP1蛋白影响骨肉瘤细胞的增殖。13、将Control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421mimic+MCPIP1蛋白分别转染到骨肉瘤MG63细胞中,通过transwell小室内突破实验检测各组骨肉瘤细胞迁移数量的改变,并检测各组迁移相关因子MMP2的蛋白水平和mRNA表达,最后评估miR-421是否能通过调控MCPIP1蛋白影响骨肉瘤细胞的迁移。14、将Control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421mimic+MCPIP1蛋白分别转染到骨肉瘤MG63细胞中,检测各组IL-6的蛋白水平和mRNA表达,最后评估miR-421是否能通过调控MCPIP1蛋白影响骨肉瘤细胞释放促炎因子IL-6。15、将分别带有control/miR-421 agomir类似物或miR-421 control/miR-421antagomir抑制剂的骨肉瘤MG63细胞（1×107）肌肉注射到裸鼠胫骨旁,16天后观察他们的成瘤效果,观察各组骨肿瘤的体积差异;分别检测各组裸鼠骨肉瘤模型骨肉瘤组织中MCPIP1,cyclin D1,bcl-2,MMP2和IL-6的蛋白水平和mRNA表达,最后评估miR-421是否能通过调控MCPIP1蛋白影响骨肉瘤动物模型的肿瘤生长和对增殖、迁移和炎症释放产生影响。结果:1、通过real-time PCR检测30个骨肉瘤患者肉瘤组织和癌旁正常骨组织中的miR-15b,miR-133b,miR-140-5p,miR-25-3p,miR-129,miR-300,miR-421,miR-422,miR-421,miR-449,miR-542等诸多miRNAs的表达水平,我们发现与对照组癌旁正常骨组织相比,骨肉瘤组织中的miR-421表达显著升高了60%。Kaplan-Meier生存曲线分析显示与低表达miR-421的骨肉瘤患者5年生存率和生存时间相比,高表达miR-421的骨肉瘤患者具有更低的5年生存率,更短的生存时间（χ2=3.842;P=0.0299）。卡方检验证实miR-421的表达与骨肉瘤患者TNM分期相关,与疾病严重程度相关。2、通过real-time PCR检测30个骨肉瘤患者肉瘤组织和癌旁正常骨组织中的中的MCPIP1的mRNA的表达。我们发现与对照组癌旁正常骨组织相比,骨肉瘤组织中的MCPIP1 mRNA表达显著降低了38%。Kaplan-Meier生存曲线显示与低表达MCPIP1 mRNA的骨肉瘤患者5年生存率和生存时间相比,高表达MCPIP1 mRNA的骨肉瘤患者具有更高的生存率,更长的生存时间（χ2=5.840;P=0.0210）,卡方检验分析显示MCPIP1的mRNA表达与骨肉瘤患者TNM分期相关,与疾病严重程度相关。3、将miR-421 control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421 inhibitor抑制剂分别转染到骨肉瘤MG63和U2OS细胞后,MTT比色法实验显示与对照组比较,过表达miR-421组在12h（12小时）,24h（24小时）,36h（36小时）和48h（48小时）OD490nm吸光值均显著升高,抑制miR-421组在4个时间点OD490nm吸光值均显著下降。4、与对照组比较,过表达miR-421骨肉瘤MG63和U2OS细胞组cyclin D1和bcl-2的蛋白水平和mRNA表达显著上调,抑制miR-421组cyclin D1和bcl-2的蛋白水平和mRNA表达显著下降。5、通过transwell小室内突破实验显示与对照组比较,过表达miR-421组骨肉瘤细胞迁移数量显著增加,抑制miR-421组迁移数量显著减少。Western blotting和real-time PCR实验显示:与对照组比较,过表达miR-421组MMP2的蛋白水平和mRNA表达显著上调,抑制miR-421组MMP2的蛋白水平和mRNA表达显著下降。6、ELISA,Western blotting和real-time PCR实验显示:与对照组比较,过表达miR-421骨肉瘤MG63和U2OS细胞组IL-6的蛋白水平和mRNA表达显著上调,抑制miR-421组IL-6的蛋白水平和mRNA表达显著下降。7、生物信息学miRDB软件预测MCPIP1与miR-421有共同的3?-UTR靶点。8、Control,miR-421和miR-421 antisense分别转染到带有pMIR-REPORTTMM vector（MCPIP1突变型）或带有pMIR-REPORTTMM vector control（MCPIP1野生型）的骨肉瘤MG63和U2OS细胞中,荧光素酶实验显示:与MG63和U2OS细胞MCPIP1野生型control组相比,MCPIP1野生型miR-421组的荧光素酶活性显著降低;但与MCPIP1突变型control组相比,MCPIP1突变型miR-421组的荧光素酶活性并没有改变。Western blotting和real-time PCR显示:与对照组相比,过表达miR-421组MCPIP1蛋白水平和mRNA表达显著下调;抑制miR-421组MCPIP1蛋白水平和mRNA表达显著提高。9、将Control对照,miR-421 mimic模拟物和miR-421mimic+MCPIP1蛋白分别转染到骨肉瘤MG63细胞中,MTT比色法实验显示:与过表达miR-421组比较,过表达miR-421+MCPIP1组在12h,24h,36h和48h四个时间点OD490nm吸光值显著下降;与过表达miR-421组比较,过表达miR-421+MCPIP1组cyclin D1和bcl-2的蛋白水平和mRNA表达显著下调。10、Transwell小室内突破实验显示:与过表达miR-421组比较,过表达miR-421+MCPIP1组骨肉瘤细胞迁移数量显著下降;与过表达miR-421组比较,过表达miR-421+MCPIP1组MMP2蛋白水平和mRNA表达显著下调。与过表达miR-421组比较,过表达miR-421+MCPIP1组IL-6蛋白水平和mRNA表达显著下调。11、将分别带有control/miR-421 agomir类似物或mi R-421 control/miR-421antagomir拮抗剂的骨肉瘤MG63细胞肌肉注射到裸鼠胫骨旁,成功建立裸鼠骨肉瘤成瘤动物模型。与control组相比,miR-421 agomir类似物组裸鼠骨肉瘤体积增加了17.61%。随后Real-time PCR和western blotting实验显示,与control相比,miR-421agomir组骨肉瘤组织中cyclin D1,bcl-2,MMP2和IL-6 mRNA和蛋白水平的表达显著上调,MCPIP1 mRNA和蛋白水平的表达显著下调;与miR-421 control组相比,miR-421 antagomir拮抗剂组裸鼠骨肉瘤体积减小了43.69%。随后real-time PCR和western blotting实验显示:与miR-421 control相比,miR-421 antagomir拮抗剂组骨肉瘤组织中cyclin D1,bcl-2,MMP2和IL-6 mRNA和蛋白水平的表达显著下调,伴有MCPIP1 mRNA和蛋白水平的表达显著上调。结论:1、MiR-421在人骨肉瘤组织中呈现高表达并与临床病理分期相关;MCPIP1在人骨肉瘤组织中呈现低表达并与疾病进展程度相关2、MiR-421能够促进体外骨肉瘤MG63细胞和U2OS细胞的增殖;并且能够增加骨肉瘤细胞中增殖相关因子cyclin D1和抑制凋亡因子bcl-2的表达3、MiR-421可以促进骨肉瘤MG63细胞和U2OS细胞的迁移;并且能增加骨肉瘤细胞中迁移相关因子MMP2的表达,还可以促进骨肉瘤细胞中促炎因子IL-6的释放4、生物信息学预测并证实MCPIP1与miR-421有共同的3?-UTR靶点;并且miR-421能够在骨肉瘤细胞中直接作用于MCPIP1的3?-UTR靶点。Mi R-421能够负向调控骨肉瘤MG63细胞和U2OS细胞中MCPIP1的表达5、MiR-421可以通过负向调控MCPIP1蛋白促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和促炎因子IL-6的释放;还可以通过调控MCPIP1蛋白促进裸鼠骨肉瘤模型的疾病进展