研究背景及目的前列腺癌是世界男性发病率第二的恶性肿瘤,严重威胁老年老年男性的身体健康。目前,针对前列腺癌的测序研究发现,前列腺癌中存在着大量的基因突变及拷贝数改变,基因层面的异常改变是前列腺癌的重要致病机制。但目前测序研究多集中在西方人群,产出的大量测序数据缺乏后续生物学验证,对前列腺癌致病的分子机制了解仍不够全面。KMT2D为组蛋白甲基化转移酶KMT2家族成员,是SET1相关蛋白复合体(COMPASSComplexe)的催化亚基,负责组蛋白H3K4mel的形成。H3K4mel是增强子活化的标志,KMT2D能够通过调控细胞H3K4mel水平,影响转录活性,参与发育、激素等相关生理过程。在癌症中,KMT2D被发现有较高的突变频率,进一步研究表明,在不同的肿瘤中,KMT2D的功能不一,可能作为肿瘤的促进基因或者抑制基因参与肿瘤的进展。而在前列腺癌中,尽管KMT2D基因有着较高的突变频率,但其致病机制目前尚不明确。研究内容1.中国人群前列腺癌病例样本靶向基因测序为了探索中国人群的前列腺癌基因突变情况,采用靶向基因测序对46例前列腺癌病例样本的32个前列腺癌高频突变进行检测,同时qRT-PCR检测25个前列腺癌相关基因的表达情况,结果发现与西方人群不同的突变谱,中国人群的显著高频突变基因KMT2D、AKAP9、GLI1,其中KMT2D突变频率最高,为63%。结合qRT-PCR检测,KMT2D突变同异常表达相关,且KMT2D基因表达水平与AR轴激活和细胞周期进展具有显著相关性。2.高频突变基因KMT2D在前列腺癌的表达情况及临床相关性除基因突变之外,表达水平也是考查基因同癌症相关性的重要因素,促癌基因多存在肿瘤组织的高表达,我们选取另一队列的51例前列腺癌样本及3例良性前列腺增生样本,进行KMT2D免疫组化染色,发现KMT2D在癌症组织表达显著高于良性前列腺增生组织,且会导致不良预后。同时ocomine数据库和cBioPortal数据库分析也证实KMT2D在肿瘤组织的高表达及同不良预后和肿瘤高侵袭性相关。因此KMT2D可能为前列腺癌的致病基因,促进癌症进展。3.MT2D基因沉默后对前列腺癌基本生物学功能影响的体外研究为了明确KMT2D在前列腺癌中的具体致病机制,采用siRNA基因沉默细胞模型,探索KMT2D缺失后对细胞基本生物学功能的影响。MTT实验和EdU增殖检测表明KMT2D沉默后显著抑制细胞的增殖活性;流式细胞检测表明KMT2D缺失后细胞阻滞在G2/M期,且细胞凋亡增多。说明KMT2D参与维持细胞正常增殖,KMT2D缺失会导致细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。转移是肿瘤的重要特征之一,划痕实验和Transwell实验发现KMT2D沉默能够抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,免疫荧光检测表明KMT2D沉默后细胞的E-cadherin表达升高,N-cadherin表达下降,说明KMT2D在肿瘤转移中起重要作用,KMT2D的缺失会抑制肿瘤细胞的迁移侵袭能力。DNA不稳定是肿瘤的重要致病机制,DNA损伤是导致DNA不稳定的重要原因。单细胞凝胶电泳表明KMT2D沉默后细胞DNA损伤增多,γ H2A.X免疫荧光及DNA损伤标志Western Blot检测证实KMT2D缺失导致DNA损伤。作为DNA损伤后的结局之一,β半乳糖苷酶染色发现KMT2D沉默后细胞衰老增多。因此KMT2D缺失会诱导DNA损伤的发生,同时促进细胞衰老。综上,KMT2D能够维持前列腺癌细胞增殖及迁移侵袭能力,抑制细胞凋亡,参与细胞DNA损伤的修复,因此,KMT2D可能作为促癌基因参与肿瘤的发生及促进肿瘤的进展。4.KMT2D基因沉默后对前列腺癌基本生物学功能影响的体内研究采用异种移植瘤模型验证KMT2D基因沉默后对前列腺癌基本生物学功能的影响,结果显示KMT2D沉默后肿瘤生长显著慢于阴性对照组,说明KMT2D维持前列腺癌肿瘤增殖活性,可能作为潜在的前列腺癌治疗靶点。5.KMT2D前列腺癌下游作用靶点的研究免疫荧光检测证实KMT2D缺失在前列腺癌中显著抑制组蛋白H3K4mel的形成。H3K4mel是增强子的标志,其水平变化能够调节下游转录活性,因此联合RNA-seq和ChIP-seq考察KMT2D缺失后细胞基因表达的差异。结果表明,KMT2D沉默后,P13K-Akt通路活化水平下降。进一步采用H3K4mel ChIP-seq探索KMT2D的直接下游靶点,发现P13K-Akt上游调节因子LIFR、EMT相关基因KLF4的H3K4mel水平显著下降,基因表达水平也降低。此外,LIFR、KLF4在前列腺癌病例中表达与KMT2D具有显著正相关性。综上,KMT2D通过调控LIFR、KLF4的H3K4mel水平,影响基因表达,进而对细胞的P13K-Akt通路及EMT相关基因的表达进行调控,影响肿瘤的生长和转移。