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目的：研究Ⅱ型糖尿病大鼠冠状小动脉血管运动功能失调与Kv通道的关系，揭示氧自由基(Superoxide，O<,2><·>)和第二信使cAMP(cyclic Adenosinemonophosphate)对糖尿病病理状态下微血管并发症的影响。初步探讨黄芪、黄连和川芎嗪三种中药对糖尿病大鼠冠状小动脉平滑肌张力的影响及其作用机制。
方法：通过腹腔内注射小剂量链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)及高脂饮食的方法诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型，应用离体小动脉灌流技术研究4-AP、KCl、glibenclamide、Nifidipine、Isoproterenol、Forskolin、黄嘌呤(xanthine，XA)、嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)合用过氧化物酶(catalase，CAT)对冠状动脉血管收缩和舒张功能失调的作用。采用离体冠状小动脉灌流技术研究去除血管内皮后，累积浓度黄芪醇提取物、黄连水煎液和川芎嗪注射液三种中药对正常和糖尿病大鼠冠状小动脉平滑肌基础张力的影响；观察三种中药对苯肾上腺素(phenylephrine，PE)和KCl预收缩的血管环的作用；和三种中药对应用4-AP、glibenclamide、无钙液、无钙液加肝素、普萘洛尔预处理后的冠状小动脉平滑肌的作用。采用全细胞膜片钳技术观察4-AP、glibenclamide、Isoproterenol、Forskolin、XA、XO、SOD合用CAT对血管平滑肌细胞Kv通道的影响。应用Western Blot和RT-PCR技术检测冠状动脉血管平滑肌细胞Kvl.2和Kvl.5通道蛋白和tuRNA的表达情况。应用特异性ELISA试剂盒检测糖尿病大鼠冠状动脉cAMP的含量。
结果：STZ和高脂饮食可致大鼠产生Ⅱ型糖尿病，模型大鼠体重与正常对照组比较明显增加，每日饮食、饮水和尿量明显增多，空腹血糖值明显增高(≥16.7mmol/L).4-AP明显抑制模型大鼠冠状小动脉平滑肌的收缩；KCI、Nifedipine和glibenclamide不引起模型大鼠冠状小动脉的收缩改变。Isoproterenol和forskolin对模型大鼠冠状小动脉平滑肌非内皮依赖性舒张作用减弱；但二者可明显改善4-AP诱导的血管收缩反应。应用XA和XO使外源性O<,2><·>生成增多，对4-AP诱导的糖尿病冠状动脉平滑肌收缩无明显作用，而氧自由基清除剂SOD和CAT同时应用可明显改善4-AP诱导的血管收缩反应。黄芪醇提取物对去内皮冠状小动脉基础张力无影响；对PE、KCl和4-AP预收缩的去内皮冠状小动脉产生剂量依赖性舒张作用；经glibenclamide、普萘洛尔和无钙液预处理后，黄芪(3.0mg/mL)对PE预收缩去内皮冠状小动脉血管环的舒张作用未被阻断，但经无钙液加肝素预处理后，该作用被显著抑制。黄连水煎液对去内皮冠状小动脉基础张力和PE预收缩的去内皮冠状小动脉产生剂量依赖性舒张作用，而对KCl预收缩的去内皮冠状小动脉无作用；经4-AP预处理后，黄连(2.0mg/mL)对PE预收缩去内皮冠状小动脉的舒张作用未被阻断，但经glibenclamide、无钙液、无钙液加肝素预处理后，该作用被显著抑制。川芎嗪注射液对大鼠冠状小动脉无直接舒张作用；对PE预收缩的去内皮冠状小动脉产生剂量依赖性舒张作用，而对KCl预收缩的去内皮冠状小动脉无作用；经4-AP、无钙液加肝素预处理后，川芎嗪(2×10<-2>mg/mL)对PE预收缩去内皮冠状小动脉的舒张作用未被阻断，但经glibenclamide和无钙液预处理后，该作用被显著抑制。Ⅱ型糖尿病大鼠4-AP敏感的冠状动脉血管平滑肌细胞Kv电流较正常组明显减小，而glibenctamide对Kv电流无影响；给予Isoproterenol和Forskolin后可以明显增加，但与正常组比较增幅较小。外源性O<,2><·>生成增多对糖尿病大鼠4-AP敏感的冠状动脉血管平滑肌细胞Kv电流无明显影响；而应用SOD和CAT后，可明显增加其电流幅度。Western blot检测可见糖尿病大鼠冠状动脉血管平滑肌钾离子通道Kvl.2和Kvl.5蛋白表达较正常对照组明显减少。RT-PCR，测定结果表明，Kvl.2和Kvl.5的mRNA含量亦明显减少。糖尿病大鼠冠状动脉血管平滑肌中cAMP含量与正常对照组比较也明显减少。
结论：STZ和高脂饮食致Ⅱ型糖尿病大鼠血管平滑肌收缩和舒张功能减弱，与血管平滑肌细胞膜Kv功能失调有关。糖尿病时冠状动脉的舒张反应通过抑制cAMP信号系统使β受体兴奋剂及腺苷酸环化酶激活剂而实现的。黄芪醇提取物对糖尿病大鼠冠状小动脉有舒张作用，其舒张作用与阻断冠状小动脉平滑肌细胞Kv通道、L-Ca<2+>通道及内质网上的三磷酸肌醇(1，4，5-triphosphateinositol,IP<,3>)敏感的Ca<2+>通道，抑制内钙的释放有关。黄连水煎液对糖尿病大鼠冠状小动脉有舒张作用，其舒张作用与阻断K<,ATP>通道和IP<,3>敏感的Ca<2+>通道，抑制细胞内钙的释放和外流有关；川芎嗪注射液对糖尿病大鼠冠状小动脉有舒张作用，其舒张作用与阻断平滑肌细胞K<,ATP>通道，抑制细胞内钙外流有关。糖尿病时血管平滑肌Kv活性降低，其电流的变化与细胞内cAMP含量有关，与K<,ATP>通道的状态无关。高糖通过刺激冠状小动脉产生过量的O<,2><·>参与糖尿病状态下的氧化应激，与糖尿病微血管张力失调密切相关，并且引起冠状小动脉Kv通道电流降低，影响Kv通道的功能，导致糖尿病冠状动脉微血管并发症。糖尿病大鼠冠状小动脉平滑肌Kvl.2和Kvl.5通道的蛋白及mRNA含量均下调，从而抑制了Kv通道的活动。大鼠糖尿病冠状动脉平滑肌cAMP含量明显降低，与冠状动脉血管平滑肌舒张功能失调有关。