研究背景及目的目前,肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中最常见的是非小细胞肺癌（Non small cell lung cancer,NSCLC）。在亚洲,有大约50%的非小细胞肺癌患者有表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变,对表皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）敏感,如最经典第一代EGFR-TKIs是吉非替尼,提示可行EGFR-TKIs靶向治疗。虽然EGFR-TKIs初期效果佳,但后期患者不可避免对其产生获得性耐药而阻碍治疗。因此,延缓或克服获得性耐药的产生是肺癌研究和治疗的重点和难点。上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮表型细胞转化为间质表型细胞的重要生物学过程,表现为上皮表型标志物E-cadherin的减少,N-cadherin等间充质表型标志物的升高;在细胞行为学上表现为细胞黏附能力的丧失,以及细胞迁移和侵袭能力的获得。EMT也是EGFR-TKIs获得性耐药的机制之一,有研究表明,肿瘤细胞越EMT化,肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性越强。间质表型的细胞较上皮表型的细胞可以提供更多的补偿轴信号促使生长抑制特异性蛋白6（growth arrest specific protein 6,Gas6）与细胞表面受体结合,逃避厄洛替尼的促凋亡信号,促使肿瘤细胞对厄洛替尼的耐药。这都揭示了 EMT在肿瘤耐药中起到的重要作用。因此,深入研究EMT,对于攻克获得性耐药机制、优化非小细胞肺癌分子靶向治疗方案有十分重要的临床意义。热休克蛋白90（Heat shock protein 90α,HSP90α）是分子量为90kDa在细胞中高度保守的分子伴侣,参与维持其客户蛋白的正确折叠,保证蛋白正常的生理功能。HSP90抑制剂（17-AGG和Ganestepid等）展开了大量临床研究,但是总以毒副作用较大等原因终止。HSP90α是HSP90的主要亚型之一,越来越多研究发现,HSP90α不仅在细胞内参与蛋白折叠等生物学功能,也可以在某种条件下释放到细胞外行使一定功能。在肿瘤细胞中,HSP90可以持续被释放到细胞外,促进肿瘤的侵袭和迁移。HSP90α在多种肿瘤患者的血清或血浆中高表达,而细胞外HSP90α在非小细胞肺癌对吉非替尼耐药方面的机制尚不清楚。铁死亡是一种以二价铁离子依赖和脂质过氧化物过度沉积驱动为特点的新型细胞死亡形式。有研究表明,铁死亡也参与肿瘤耐药的发生和发展,金属硫蛋白1G通过抑制铁死亡促进肝癌细胞对索拉菲尼耐药。但是,铁死亡与细胞外HSP90α的关系以及在非小细胞肺癌中对吉非替尼耐药机制的研究甚少。我们研究发现,EGFR突变的非小细胞肺癌患者血浆中HSP90α的水平高于对照组。通过构建裸鼠异体移植瘤的体内实验,揭示了 GW4869增强吉非替尼的抗肿瘤活性。在对吉非替尼敏感的非小细胞肺癌细胞系中,发现细胞外HSP90α促进EMT的发生,也促进细胞的侵袭和迁移;细胞外HSP90α上调LRP1,引起下游AKT等信号通路的激活,同时细胞外HSP90α通过抑制铁死亡的发生,促进EMT的发生,促进对吉非替尼耐药。因此,我们从临床样本、体内实验和体外实验三个层面,探讨了在非小细胞肺癌中,细胞外热休克蛋白90α对在对吉非替尼敏感的上皮间充质转化的作用及机制,这可能为延缓和克服非小细胞肺癌中EGFR-TKIs产生的获得性耐药提供新的思路,为EGFR突变的非小细胞肺癌个体化治疗提供潜在的治疗策略。研究方法1.临床标本检测:通过ELISA检测22例EGFR突变的非小细胞肺癌患者和10例对照组的血浆样本中HSP90α的水平。2.Westernblot:检测细胞外 HSP90α,EMT 标志物（E-cadherin,N-cadherin和Vimentin蛋白水平）及铁死亡标志物（Cox-2和GPX4）。3.划痕试验:用200μl移液管尖刮取皿底的细胞,予PBS轻轻冲洗皿底残留细胞,培育一定时间后用光学显微镜拍照细胞迁移情况,计算相对迁移率,并用Image J软件进行分析。4.Transwell:将密度为7×104的细胞铺于已经铺好基质胶的Transwell孔板的上室中孵育一定时间,在4%多聚甲醛中固定,PBS洗涤,结晶紫染色。在显微镜下拍照获得图像,计算从上室通过到下室膜上的细胞数。5.Liperfluo:将密度为5×104的细胞悬液铺种于培养皿中,予TGF-β1和hrHSP90α预处理,将Liperfuo粉末与一定体积DMSO混合成工作液,按需加入培养基中,避光放置细胞孵育箱孵育20min,用共聚焦显微镜进行拍摄。6.裸鼠异体移植瘤:Balb/c裸鼠（15g-20g,4-6周龄）在其腋下皮下注射HCC827成瘤,分组,灌胃给药,第28天时,经腹腔注射麻醉后眼球取血。采血完成后,对肿瘤进行切除分离,称重,拍照,肿瘤组织经4%多聚甲醛固定24h-48h后进行免疫组化。7.免疫组化:将肿瘤切片进行脱蜡:抗原修复,封闭,内源性阻断,一抗（E-cadherin,Vimentin）置于湿盒4℃孵育过夜,二抗室温孵育,DAB显色,脱色,脱水,封片,镜下观察及拍照。8.统计数据:使用Graphpad Prism5.0软件和SPSS 20.0分析数据,计量资料使用均数±标准差（S.D）,均数满足方差齐性时,数据采用单向方差分析（one way ANOVA）,组间比较采用Bonferroni法比较;不满足方差齐性时,均数比较采用Welch法比较,组间多重比较采用Tamhane’s T2检验比较,认为*P＜0.05具有统计学意义。结果1.EGFR突变的非小细胞肺癌患者的血浆中HSP90α水平高于对照组。细胞外HSP90α对TGF-β1有浓度依赖性并促进EMT的发生,hrHSP90α增强TGF-β1促EMT的能力,通过siRNA沉默细胞内HSP90α可显著降低N-cadherin和Vimentin的蛋白水平。通过划痕试验和Transwell发现细胞外HSP90α促进细胞的迁移和侵袭。2.在裸鼠异体移植瘤中,GW4869和吉非替尼组联合组的肿瘤体积小于吉非替尼组。在血清样本检测中,GW4869和吉非替尼联合组的血清中HSP90α水平低于吉非替尼组。免疫组化分析还表明GW4869和吉非替尼组联合组较吉非替尼组的N-cadherin水平降低,E-cadherin水平升高。细胞外HSP90α对GW4869有浓度依赖性,且EMT和细胞的侵袭和迁移也被抑制。TGF-β1和GW4869的联合可以抑制TGF-β1诱导的细胞外HSP90α和细胞外HSP90β的增加,并逆转TGF-β1诱导的EMT过程及细胞的侵袭和迁移。3.TGF-β1促进NSCLC细胞系中LRP1的表达上调,siRNA沉默LRP1促进了 E-cadherin的表达和铁死亡的发生。在siRNA沉默LRP1的细胞中用hrHSP90α预处理时,EMT和铁死亡得到逆转。通过CCK-8检测,hrHSP90α和Ferrostatin-1共处理的IC50高于hrHSP90α预处理组,hrHSP90α预处理的IC50高于对照组。在慢病毒转染shHSP90α和shNC PC9中,p-ERK、p-AKR、p-EGFR和p-MET等的蛋白水平出现下调。4.hrHSP90α能增强TGF-β1抑制铁死亡的能力。Ferrostain-1和TGF-β1共处理细胞可抑制铁死亡,促进EMT。该现象可以通过siRNA沉默GPX4被抑制。用hrHSP90α处理的si-GPX4组可以抑制E-cadherin的表达和促进GPX4、Vimentin 和 N-cadherin 的上调。Ferrostatin-1 能增强 hrHSP90α 促进 HCC827 和PC9对吉非替尼的耐药。结论1.HSP90α的高水平与非小细胞肺癌EGFR突变患者疾病发生相关。2.GW4869增强EGFR突变的非小细胞肺癌裸鼠异体移植瘤模型对吉非替尼的敏感性。3.细胞外HSP90α通过上调LRP1,抑制铁死亡的发生,促进非小细胞肺癌的EMT及细胞侵袭与迁移。