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目的:多囊卵巢综合症（PCOS）是育龄女性群体中一种发病率较高的异质性疾病,具有雄激素过量、多囊卵巢形态及排卵功能障碍的主要特征。目前,PCOS的治疗仍是临床挑战。自噬是一种保守的溶酶体分解代谢途径,为细胞提供必需营养素,降解受损的蛋白质和细胞器,对于维持细胞稳态和发育很重要。自噬受到许多因素的密切调控。胰岛素样生长因子2（IGF2）可通过IGF2-R的tis受体调节自噬,而mi R-34c-5p可以通过靶向多种细胞中的自噬关键蛋白ATG4B来抑制自噬。自噬在生殖疾病中异常激活的影响因素可能为排卵异常、雄激素过高等。课题组前期研究发现,在PCOS患者的卵巢组织中检测到显著增强的自噬活性。然而,关于在PCOS过程中哪些因素会增强卵巢组织中的自噬,仍知之甚少。长链非编码RNA（Lnc RNA）属于一类长度较大的非编码RNA。在功能上,lnc RNA可以作为竞争性内源性RNA（ce RNA）吸收其靶向micro RNA（mi RNA）以增强下游基因表达或与特定的转录因子交互而控制靶基因表达。以往研究表明,卵泡液中的lnc RNAs调节人类PCOS的发展和进展。近期的其他研究成果也表明,lnc RNA调节性激素分泌、卵巢颗粒细胞（GCs）表型和其他PCOS相关的内分泌代谢过程。此外,lnc RNAs可以在其他代谢疾病的过程中调节细胞自噬,例如糖尿病和心血管疾病。然而,在PCOS过程中,可调节GCs自噬的lnc RNA尚未阐明。课题组前期通过RNA测序技术,首次发现并命名了一个lnc RNA RP11–705C15.3,其在PCOS患者中表达低于正常女性,但RP11-705C15.3是否能在PCOS过程中调节GCs的自噬尚不清楚。本课题的主要目的是深入揭示RP11–705C15.3在PCOS进展中可能发挥的重要作用,进一步研究探索RP11–705C15.3在PCOS中充当ce RNA海绵吸附mi R-34c-5p以增强IGF2表达并抑制GCs自噬的分子机制,并明确RP11–705C15.3/mi R-34c-5p/IGF2轴介导的自噬对于PCOS表型的影响,为PCOS的治疗提供新的临床分子靶点和标志物。研究方法∶1、收集20例PCOS患者和20例卵巢功能正常女性的卵巢颗粒细胞（GCs）样本,采用RT-PCR检测RP11-705C15.3的表达水平。人卵巢颗粒细胞瘤细胞系（KGN和COV434）购自中国科学院细胞库,与带有10%胎牛血清（Gibco,美国）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基（Gibco,美国）在37℃,5%CO2的培育箱中培育。RP11-705C15.3-si RNA和阴性对照、RP11-705C15.3过表达和对照质粒购自Gene Pharma（中国）,使用Lipo3000（Invitrogen）转染KGN和COV434细胞,q RT-PCR定量检测转染效率。使用CCK8、划痕实验、Transwell法侵袭实验及Annexin V-APC/7-AAD法凋亡实验检测细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡能力的改变。通过Western blot检测自噬蛋白LC3-II/I,ATG5,ATG7及P62蛋白表达的变化。转染m RFP-GFP-LC3探针（汉恒,中国）,镜下对荧光蛋白信号进行检测,对样本包埋后切片并观察同时采集照片。2、从GEO网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载mi RNA数据集,生物信息学方法分析PCOS中差异表达的mi RNA。RT-PCR检测20对PCOS患者和卵巢功能正常女性的GCs样本中mi R-34c-5p和IGF2的表达水平。生物信息学网站（https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/）预测RP11-705C15.3与mi R-34c-5p及IGF2的关键结合位点,双荧光素酶报告实验及RNA pull down实验检测RP11-705C15.3与mi R-34c-5p及IGF2的靶向结合。mi R-34c-5p模拟物和阴性对照、mi R-34c-5p抑制剂和阴性对照、IGF2-sh RNA和对照、IGF2过表达和对照质粒购自Han Bio（中国上海）,使用Lipo3000（Invitrogen）转染KGN和COV434细胞,q RT-PCR定量检测转染效率。使用Western blot检测自噬蛋白LC3-II/I,ATG5,ATG7及P62蛋白表达的变化。转染m RFP-GFP-LC3探针（Gene Pharma,中国上海）,镜下观察荧光蛋白信号。对细胞样本进行包埋后电镜观察并采集照片。3、用细胞转染法构建RP11-705C15.3与mi R-34c-5p共转染的KGN和COV434细胞系,q RT-PCR检测IGF2的表达水平。用细胞转染技术方法构建mi R-34c-5p与IGF2,RP11-705C15.3与IGF2共转染的KGN和COV434细胞系。利用Western blot检测自噬蛋白LC3-II/I,ATG5,ATG7及P62,PI3K/Akt信号通路蛋白PI3K,p-PI3K,AKT及p-AKT表达的变化。转染m RFP-GFP-LC3探针（Gene Pharma,中国上海）,在荧光显微镜下观察荧光蛋白信号。对细胞样本进行脱水包埋,透镜观察并采集照片。皮注脱氢表雄酮来构建PCOS大鼠模型,通过HE染色观察大鼠卵巢组织形态,利用q RT-PCR检测RP11-705C15.3、mi R-34c-5p和IGF2在大鼠卵巢中的表达。RP11-705C15.3过表达及对照质粒购自Gene Pharma（中国上海）。将21只模型大鼠划分为三组,RP11-705C15.3-OE组、RP11-705C15.3-NC组和对照组,每组各7只,尾静脉注射相应质粒或生理盐水。采用q RT-PCR检测卵巢组织转染效率。检测和比较各组体重、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FSI）指标及HOMA-IR。HE染色检测和比较各组卵巢组织形态,采用Western blot法检测和比较各组卵巢组织IGF2、LC3-II/I、ATG5、ATG7及P62蛋白表达的变化。采用免疫组化检测LC3B及P62在大鼠卵巢组织的表达。结果:1、RP11-705C15.3在PCOS患者GCs中表达降低（P＜0.0001）。体外实验表明,RP11-705C15.3的过表达抑制KGN和COV434细胞的自噬。过表达RP11-705C15.3可降低细胞中LC3-II/I、ATG7、ATG5的表达,提高P62的表达,且显著下调了细胞中自噬小体量。2、mi R-34c-5p在PCOS患者GCs中表达显著上调,且荧光素酶报告基因和RNA下拉证实其与RP11-705C15.3存在结合位点。RP11-705C15.3过表达可降低KGN和COV434细胞中的mi R-34c-5p转录水平。mi R-34c-5p敲减后降低了LC3-II/I、ATG5和ATG7的表达,增加了P62的表达,也明显抑制了KGN和COV434细胞中自噬小体的形成。IGF2的3’UTR包含mi R-34c-5p的结合序列,荧光素酶报告基因实验表明mi R-34c-5p靶向GCs中IGF2的3’UTR。IGF2沉默增强了KGN和COV434细胞的自噬。3、RP11-705C15.3通过海绵效应调节GCs样KGN和COV434细胞中的mi R-34c-5p以增强IGF2表达。mi R-34c-5p模拟物可增强RP11-705C15.3沉默引起的自噬增加,也因IGF2的过表达而恢复调控。RP11-705C15.3/mi R-34c-5p/IGF2轴通过PI3K/Akt通路调控自噬。RP11-705C15.3质粒处理PCOS大鼠缓解了PCOS大鼠卵巢的形态特征,使卵巢组织中的自噬降低,减少LC3B表达,增加P62表达,同时部分增强了PCOS大鼠卵巢组织降低mi R-34c-5p表达,并降低了IGF2表达。RP11-705C15.3治疗也可部分改善PCOS大鼠的胰岛素抵抗。结论:PCOS患者的GCs和PCOS大鼠的卵巢组织中RP11-705C15.3表达下调,RP11-705C15.3过表达治疗减轻了PCOS大鼠卵巢组织的病理变化。RP11-705C15.3通过海绵吸附mi R-34c-5p以增强IGF2表达抑制GCs自噬以改善PCOS症状。因此,RP11-705C15.3/mi R-34c-5p/IGF2轴可能在PCOS进展过程中发挥重要作用。