基于重水拉曼技术的根管冲洗液对白色念珠菌抑菌效能的研究

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目的:探究重水拉曼技术用于评价真菌代谢活性的普适性以及临床常用根管冲洗液对白色念珠菌的抑菌效能,为后期指导临床合理使用根管冲洗液,减少根管反复感染、难治性根尖周炎及根管治疗失败的发生机率奠定基础。方法:(1)不同浓度重水作用于白色念珠菌ATCC 10231后,首先利用生长曲线仪测定目标菌株细胞的吸光度值OD600随时间的变化,其次利用单细胞拉曼分选仪器测定白色念珠菌的单细胞拉曼图谱(SCRS)并计算C-D ratio(重水峰所占比例)值,分别探究重水对白色念珠菌生长的影响及白色念珠菌对重水的吸收规律,以系统的评价重水拉曼技术用于评价真菌代谢活性的普适性。(2)采用肉汤稀释法,探究三种临床常用的根管冲洗液,包括氯己定(CHX)、次氯酸钠(Na Cl O)、过氧化氢(H2O2)对白色念珠菌生长状态的影响,参考指标为最低抑菌浓度(MIC);采用重水拉曼技术,探究三种根管冲洗液对白色念珠菌代谢活性的影响,参考指标为最低代谢活性抑制浓度(MIC-MA);比较三种根管冲洗液作用于白色念珠菌的MIC及MIC-MA,以探讨白色念珠菌不生长但具有代谢活性(NGMA)细胞状态的存在与否。(3)以三种根管冲洗液各自的MIC-MA为参考,尝试将三种根管冲洗液以更低的浓度进行两两联合使用,采用重水拉曼技术,分别比较根管冲洗液联合使用与单独使用以及不同联用组合之间对白色念珠菌代谢活性的作用效果差异。结果:(1)白色念珠菌在≤30%的重水环境中,生长未受到明显抑制(p>0.05),在≥40%的重水环境中,生长受到明显抑制(p<0.05);生理状态下的白色念珠菌能够活跃积极的代谢重水,并能通过拉曼图谱特定的区域(2024~2300cm-1)以重水峰(C-D峰)的形式体现,且重水峰面积与重水浓度呈线性正相关关系(R2=0.9894,p<0.01)。因此,C-D峰可以用来量化白色念珠菌细胞代谢重水的能力,以表征细胞的代谢活性。基于此,本实验选取既不影响实验菌株生长又能产生明显C-D峰的重水浓度,即30%重水作为后续实验的默认重水浓度。(2)CHX、Na Cl O、H2O2这三种根管冲洗液作用于白色念珠菌的MIC分别为4μg/ml,168μg/ml,60μg/ml;MIC-MA分别为8μg/ml,336μg/ml,120μg/ml。在三种根管冲洗液的MIC作用下,白色念珠菌的生长均受到完全抑制,但仍具有一定程度的代谢活性。CHX、Na Cl O、H2O2在各自的MIC作用下,白色念珠菌细胞的代谢活性抑制程度分别为0.4%,93.9%,94.1%,揭示了基于传统方法的MIC水平作用于白色念珠菌后,细胞生长虽受到完全抑制,但仍存在代谢活性,即白色念珠菌NGMA细胞状态的存在。只有当根管冲洗液的浓度达到MIC-MA水平时,白色念珠菌的代谢活性才能得到完全抑制。(3)三种根管冲洗液两两联合使用作用于实验菌株,只有Na Cl O和H2O2在各自更低浓度,即Na Cl O(0.5×MIC-MA)和H2O2(0.5×MIC-MA)的联合作用下,达到完全抑制白色念珠菌代谢活性的作用效果,而其余组合的根管冲洗液联合作用后,白色念珠菌仍然存在一定程度的代谢活性。结论:重水拉曼技术能够精准、定量的评价药物对真菌代谢活性的影响。MIC作用下,细胞生长虽然受到完全抑制,但代谢活性仍然存在,证实了白色念珠菌NGMA细胞的存在,只有升高浓度至MIC-MA,细胞的生长及代谢才能均受到完全抑制。因此,推荐MIC-MA作为药敏性研究的常规参考指标。在根管冲洗液的联合应用中,Na Cl O和H2O2的联用效果更佳,在各自更低浓度的联合作用下,便能够达到完全抑制白色念珠菌细胞代谢活性的效果。综上,本研究将为后期椅旁快速筛选药物、减少药物毒副作用、指导临床精准用药以及提高根管治疗的成功率奠定基础。
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