多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病,其以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主,特别是Th1和Th17细胞亚群过度激活,穿过血脑屏障迁移到中枢神经系统,使中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润,上述炎性细胞分泌相应炎性介质,吸引更多炎性细胞的浸润,神经元之间的联系遭到破坏,从而导致一系列的神经功能障碍。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是国际公认的MS动物模型,其发病机理与MS基本一致。目前越来越多的证据表明Th17在MS/EAE的发病过程中发挥更为关键的作用。Th17细胞上特异性表达的趋化因子受体有CCR2、CCR4和CCR6,Th17细胞浸润到中枢神经系统中是受到相应的趋化作用的影响。IFN-β是一种天然存在于机体内的蛋白质,是FDA批准的首个用于MS治疗的药物,其能够缓解MS的疾病严重度,但是关于IFN-β在趋化作用方面的干预机制还有待进一步研究。微小RNA（micro RNA,miRNA）是近年来新发现的一类内源性非蛋白编码的单链小分子RNA。自miRNA被发现以来,已有大量的研究证实多种miRNA参与MS的多个疾病过程,表明miRNA在MS中发挥重要作用,研究miRNA可为MS的发病机制和靶向治疗提供新的理论基础和临床靶点。本课题组前期发现IFN-β通过影响Th17细胞的分化进而缓解MS/EAE的疾病严重度,但是将IFN-β影响Th17细胞的分化与miRNA联系起来加以研究还有待进一步深入。本研究以EAE作为疾病模型,检测和分析IFN-β干预引起EAE小鼠差异表达的miRNA,确定miR-322-5p为研究靶标;探讨miR-322-5p在IFN-β抑制的EAE小鼠中对Th17细胞趋化和分化的作用,进而影响EAE疾病进程的机制。首先,本课题通过MOG35-55肽段免疫C57BL/6小鼠,建立EAE动物模型,于造模第三天给予IFN-β干预,对照组给予同等剂量的无菌PBS,于疾病初期和高峰期分别处死小鼠,利用FACS和real-time PCR的方法检测脾脏、脑和脊髓中Th17细胞的比例和特异性表达CCR2、CCR4和CCR6的Th17细胞的比例以及相应趋化因子受体的m RNA表达水平;其次,从miRNA芯片检测结果中发现IFN-β组和PBS组小鼠之间存在的差异表达miRNA,筛选出miR-322-5p作进一步研究,利用靶基因预测软件、real-time PCR、Western Blotting、脂质体转染以及经典的荧光素酶报告基因系统等实验方法验证miR-322-5p及其预测靶基因的表达,最终确定miR-322-5p的直接靶基因;之后,在EL4细胞系和CD4+T细胞中过表达miR-322-5p,利用Transwell实验探究CCL2对EL4和CD4+T细胞迁移能力的影响,在CD4+T细胞中过表达miR-322-5p后探究miR-322-5p对Th17细胞体外分化能力的影响;最后,观察体内注射miR-322-5p模拟物对EAE小鼠疾病进程的影响,并检测相应指标。结果发现,无论是疾病初期还是高峰期,与PBS组相比,IFN-β组小鼠的脾脏和中枢神经系统中,Th17细胞的比例均显著降低,脾脏中表达CCR2、CCR4的Th17细胞的比例显著降低,中枢神经系统中表达CCR2、CCR4和CCR6的Th17细胞的比例有下降的趋势,同时CCR2、CCR4和CCR6的m RNA表达水平也显著降低,miR-322-5p表达显著上调,预测靶基因CCR2和Akt3的表达显著下调,荧光素酶报告基因系统最终证明miR-322-5p直接靶向作用于CCR2和Akt3;过表达miR-322-5p显著抑制Th17细胞的迁移能力以及分化能力;体内注射miR-322-5p模拟物能够明显缓解EAE的疾病严重程度。上述结果表明,IFN-β干预可以通过提高miR-322-5p的表达从而降低CCR2和Akt3的表达,抑制Th17细胞的趋化与分化,从而缓解EAE的疾病进程;体内注射miR-322-5p模拟物能够缓解EAE的疾病进程。