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PNO1（homo sapiens partner of NOB1 homolog）是NOB1的同系物,与NOB1共同参与与RNA结合的过程。PNO1位于细胞核,尤其是核仁,存在于多种组织中,例如:肝脏、肺、肾脏等组织中高表达,而在睾丸和卵巢组织中的表达量较少。PNO1基因家族在真核和原核生物均表达并表现出很多重要的作用。本文研究了PNO1在上皮性卵巢癌细胞发生增殖和凋亡过程中所发挥的作用。首先,我们检测了PNO1在四种不同的上皮性卵巢癌细胞中的表达情况并选取SKOV3细胞作为后续实验的研究对象。应用慢病毒sh RNA感染目的细胞并且检测PNO1的敲减效率,然后利用MTT实验技术和celigo仪器检测细胞增殖、生长情况,实验结果表明PNO1表达下调后SKOV3细胞的增殖水平减弱。克隆能力的强弱也是反映细胞增殖能力的另一个方面,所以我们又做了平板克隆形成实验,结果也表明PNO1表达下调后细胞的克隆能力降低。肿瘤细胞凋亡能力能否被减弱直接关系着癌症的发生发展,所以进一步进行了细胞凋亡实验,实验表明PNO1敲减后凋亡能力被增强。为了探究PNO1的作用机制,我们引用了细胞信号通路抗体芯片技术。检测结果表明,PNO1敲除后AMPKα的磷酸化水平下调,说明PNO1可能是通过AMPK的活化而发挥作用。总而言之,我们的研究发现了PNO1敲除后对上皮性卵巢癌细胞的发生发展有一定的抑制作用,并通过进一步研究发现了可能的作用机制,将来有可能为卵巢癌的早期诊断和综合治疗提供新的基因靶点。第一部分PNO1在上皮性卵巢癌中的表达情况目的:检测PNO1在上皮性卵巢癌细胞系中的表达水平。方法:1.分别收集卵巢良性肿瘤和上皮性卵巢癌组织标本,通过免疫组化技术检测PNO1在相关组织中的表达。2.培养四种上皮性卵巢癌细胞HEY、SKOV3、HO8910、OVCAR3及人永生化正常卵巢上皮细胞Moody,并分别提取RNA,通过real-time q PCR实验方法检测每一种细胞中PNO1在m RNA的表达丰度值,以GAPDH作为内参。3.培养四种上皮性卵巢癌细胞HEY、SKOV3、HO8910、OVCAR3及人永生化正常卵巢上皮细胞Moody,并分别提取蛋白,通过Western blotting实验方法检测每一种细胞中PNO1在蛋白水平的表达情况,以GAPDH作为内参。结果:（1）与卵巢良性肿瘤组织相比,PNO1在上皮性卵巢癌组织中的表达明显阳性。（2）real-time qPCR实验结果显示,与内参GAPDH相比,中的相对表达丰度均较高,其中最高的是HO8910。（3）Weatern blotting结果显示,PNO1在上皮性卵巢癌细胞株HO8910、OVCAR3、SKOV3、HEY中的表达明显高于正常卵巢上皮细胞Moody。结论:PNO1在上皮性卵巢癌中高表达。第二部分慢病毒构建和转染及敲减效率检测目的:构建携带PNO1 shRNA的慢病毒同时检测转染效率和PNO1的敲减效率。方法:根据说明书提供的操作步骤,分别构建携带PNO1 shRNA的慢病毒和对照组慢病毒。将慢病毒感染目的细胞SKOV3,由于慢病毒携带有荧光标记物,所以可以在转染72小时后观察转染的情况及细胞生长状态。然后分别利用real-time q PCR和western blotting实验技术检测PNO1sh RNA在m RNA和蛋白水平上的敲减效率,若敲减效率不达标,要重新构建慢病毒。结果:1.携带PNO1的shRNA慢病毒感染细胞效率达70%以上,并且目的细胞状态良好,构建的慢病毒可以用于后续实验。2.在转染48小时后提取RNA,用real-time q PCR技术检测PNO1在m RNA水平表达被敲减效率达到68.8%,敲减效率基本满意。3.在转染72小时后提取蛋白,用western blotting实验技术检测PNO1在蛋白水平被敲减效果也很明显。结论:慢病毒感染细胞效果满意,敲减效率合格。第三部分PNO1敲减后对细胞增殖的影响目的:检测PNO1表达抑制后对上皮性卵巢癌细胞增殖产生的影响。方法:先用慢病毒感染目的细胞,培养72小时后开始连续5天用MTT实验技术对细胞的增殖力进行检测,比较转染组和对照组在细胞增殖力方面有何变化。另外,在转染72小时后,连续5天用celigo对细胞计数,追踪细胞生长情况,可以进一步明确细胞增值力的改变。对慢病毒感染72小时后的SKOV3细胞进行平板克隆形成实验,连续11天观察PNO1敲除后克隆能力的改变。结果:1.MTT实验技术检测结果表明实验组与对照组相比,所观察5天内其增值力明显下降。2.celigo细胞计数结果表明实验组与对照组相比,所观察5天内活细胞的数量明显下降。3.平板克隆实验表明实验组与对照组相比,其克隆形成的细胞团数量明显减少,形状明显减小。结论:PNO1敲除后能抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖。第四部分PNO1敲减后对细胞凋亡的影响目的:通过慢病毒转染目的细胞SKOV3抑制PNO1表达后对细胞凋亡的影响。方法:慢病毒感染目的细胞SKOV3 3天后传代,传代2天后用Annexin V对细胞进行荧光标记,利用流式细胞仪检测转染组和对照组早期凋亡的细胞数量,进而反应细胞凋亡能力的改变。结果:实验组与对照组相比较,在转染5天后早期凋亡的细胞数量平均为18.84%,而对照组凋亡的细胞数量平均为4.53%,结论:PNO1敲减后能促进上皮性卵巢癌细胞的凋亡。第五部分PNO1影响细胞增值和凋亡的作用机制目的:为了探究PNO1影响上皮性卵巢癌增殖和凋亡的作用机制。方法:慢病毒感染细胞72小时后,收集细胞并溶解。利用细胞信号通路抗体芯片,每一步都严格根据说明书进行。转染组和对照组相比较,观察信号通路的关键因子发生的变化,并具有统计学意义,进而探究PNO1发挥作用的信号通路。结果:细胞信号通路抗体芯片结果显示,实验组与对照组相比,PNO1敲除后AMPKα的磷酸化水平发生了下调,并通过灰度值比较,该变化具有统计学意义。结论:说明PNO1可能通过AMPK相关细胞通路发挥作用。