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猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染是引起仔猪死亡的“第一杀手”,7日龄以内仔猪感染死亡率可高达100%,给我国养猪业带来严重危害。目前,尽管PEDV疫苗在我国被广泛应用,但是PEDV感染仍然频繁发生。因此,PEDV感染机制以及基于感染机制相关抗病毒策略的研究十分必要。前期研究显示,PEDV N蛋白通过介导细胞周期S期阻滞增强病毒复制,但是如何增强病毒复制的分子机制尚不明晰。该科学问题的探究将为PEDV感染机制阐明及抗病毒药物靶标设计提供理论基础。针对该科学问题,本研究利用TMT标记定量蛋白质组学技术,挖掘PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞增强病毒复制的关键蛋白,进一步明确筛选的关键蛋白对PEDV复制的影响及机制。具体研究内容如下:1.PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞增强病毒复制关键蛋白的筛选为了挖掘PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞增强病毒复制关键蛋白,本研究利用TMT标记定量蛋白质组学技术对PEDV N和胸苷(Thymidine)阻滞剂介导的S期阻滞状态的Vero E6细胞蛋白表达谱进行了分析,进一步利用Western blot等对差异表达蛋白进行鉴定。结果显示,PEDV N蛋白和胸苷分别介导54%和42%的Vero E6细胞处于S期阻滞,显著高于对照细胞(32%和21%)(p<0.05)。上述数据显示,本研究成功制备了PEDV N蛋白和胸苷介导Vero E6细胞S期阻滞的样品。TMT标记定量蛋白质组学显示,在PEDV N组和胸苷组细胞中共鉴定5 709个蛋白,其中PEDV N组细胞中差异蛋白为58个(27个蛋白上调表达;31个蛋白下调表达),胸苷组中差异蛋白为26个(15个蛋白上调表达;11个蛋白下调表达)。GO分析结果显示,PEDV N组差异蛋白参与的生物进程集中在染色质重塑、核小体组装、染色质组装或拆卸等;具有的分子功能集中在结构分子活性、脂质磷酸酶活性、氧化还原酶活性、NADH脱氢酶活性等;构成的细胞成分集中在中间丝、大分子复合物、细胞内无膜边界的细胞器、细胞骨架等。胸苷组差异蛋白参与的生物进程集中在d TMP代谢及生物合成过程、嘧啶脱氧核糖核苷单磷酸代谢及生物合成过程、DNA包装等;具有的分子功能集中在胸苷酸合酶活性、牛磺酸跨膜转运活性、蛋白质跨膜转运活性、大分子跨膜转运活性等;构成的细胞成分集中在蛋白质复合物、线粒体蛋白复合物、核小体、DNA包装复合物等。KEGG pathway分析显示,PEDV N组差异蛋白富集在氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、神经活性配体与受体相互作用等通路;胸苷组差异蛋白富集在视黄醇的新陈代谢、内吞作用、代谢途径等通路。蛋白质相互作用网络分析(PPI)显示,PEDV N组差异蛋白轴突动力蛋白重链9(DNAH9)、核糖体蛋白RPL10和核糖体蛋白RPL15可以与互作网络数据库中收录的其他蛋白质发生相互作用。Western blot结果显示,核糖体蛋白RPL18在PEDV N和胸苷介导S期阻滞的Vero E6细胞和猪小肠上皮细胞(IPEC J2)中表达水平显著升高(p<0.05),与TMT定量蛋白质组学鉴定结果一致;PEDV CV777经典毒株和HM2017变异毒株感染Vero E6和IPEC J2细胞后,核糖体蛋白RPL18表达水平显著升高(p<0.05)。上述结果显示,细胞核糖体蛋白RPL18与PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞增强病毒复制具有高度的相关性。2.核糖体蛋白RPL18对PEDV病毒复制的影响为了明确核糖体蛋白RPL18对PEDV体外复制的影响,本研究通过核糖体蛋白RPL18在Vero E6和IPEC J2细胞中过表达和沉默,检测PEDV在靶细胞中复制水平,进一步通过生物膜干涉技术检测核糖体蛋白RPL18和PEDV N蛋白相互作用。结果显示,当核糖体蛋白RPL18在IPEC J2细胞中过表达时,PEDV CV777经典毒株感染靶细胞后TCID50在48小时为4.625 log10TCID50/m L,显著高于对照组(4.167 log10TCID50/m L)(p<0.05);PEDV HM2017变异毒株感染靶细胞后TCID50在48小时为5.417 log10TCID50/m L,极显著高于对照组(4.542 log10TCID50/m L)(p<0.001);Western blot结果显示,PEDV CV777经典毒株和HM2017变异毒株感染过表达RPL18的IPEC J2细胞后,PEDV S蛋白表达水平均显著升高(p<0.05)。该结果表明,核糖体蛋白RPL18在IPEC J2细胞中过表达后能显著增强PEDV复制。当核糖体蛋白RPL18在Vero E6细胞中沉默时,PEDV CV777经典毒株感染靶细胞后TCID50在48小时为4.208 log10TCID50/m L,显著低于对照组(4.833 log10TCID50/m L)(p<0.05);PEDV HM2017变异毒株感染靶细胞后TCID50在48小时为5.417log10TCID50/m L,极显著低于对照组(6.125 log10TCID50/m L)(p<0.01);Western blot结果显示,PEDV CV777经典毒株和HM2017变异毒株感染沉默RPL18的Vero E6细胞后,PEDV S蛋白表达水平均显著降低(p<0.05)。当核糖体蛋白RPL18在IPEC J2细胞中沉默时,PEDV CV777经典毒株感染靶细胞后TCID50在48小时为5.125 log10TCID50/m L,显著低于对照组(5.583 log10TCID50/m L)(p<0.05);PEDV HM2017变异毒株感染靶细胞后TCID50在48小时为6.208 log10TCID50/m L,显著低于对照组(6.958 log10TCID50/m L)(p<0.05);Western blot结果显示,PEDV CV777经典毒株和HM2017变异毒株感染沉默RPL18的IPEC J2细胞后,PEDV S蛋白表达水平均显著降低(p<0.05)。该结果表明,核糖体蛋白RPL18在Vero E6细胞和IPEC J2细胞中沉默后能显著抑制PEDV复制。上述结果显示,核糖体蛋白RPL18在Vero E6细胞和IPEC J2细胞中能增强PEDV复制。本研究进一步利用生物膜干涉技术分析了核糖体蛋白RPL18与PEDV N蛋白之间的相互作用,结果显示,核糖体蛋白RPL18与PEDV N蛋白无直接相互作用。综上所述,本研究利用TMT标记定量蛋白质组学技术系统鉴定了PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞时靶细胞差异表达蛋白谱,揭示了PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞增强病毒复制的靶细胞中关键蛋白信息和重要生物进程,明确核糖体蛋白RPL18增强PEDV经典毒株和变异毒株复制。本研究为PEDV介导宿主细胞周期阻滞促进病毒复制分子机制阐明以及新的抗病毒药物靶点设计提供理论基础。