【摘 要】
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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的接触性传染病,给当前养猪业造成巨大的经济损失。PEDV是单
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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的接触性传染病,给当前养猪业造成巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,包含7个开放阅读框,其中ORF1a和ORF1b编码的两个多聚蛋白PP1a和PP1ab能被切割成16个非结构蛋白(Non-structural proteins,NSPs)。这些NSPs具有独特的酶活性,在病毒复制及转录过程中发挥重要的调控作用。为了深入解析PEDV病毒非结构蛋白NSP8与宿主细胞蛋白的互作关系,主要研究内容如下:(1)对SHpd/2012毒株的全基因分析及序列比对得到高度保守的NSP8序列,并制备可特异性识别PEDV NSP8蛋白的高效价多克隆抗体。(2)将猪肾细胞cDNA文库与诱饵质粒pGBKT7-nsp8杂交后,通过选择性培养基筛选及回转实验,在酵母双杂交系统中得到4个与NSP8蛋白存在互作的宿主细胞蛋白:乳酸脱氢酶B链(LDHB)、SERTA结构域3(SERTAD3)、G蛋白信号调节蛋白2(GMS2)和蛋白酶体亚基β型10(PSMB10),均与细胞内信号通路相关。其中,LDHB能够促进溶酶体酸化后帮助细胞进行自噬,而病毒复制复合物的形成依赖于自噬现象。(3)通过免疫共沉淀和间接免疫荧光确认LDHB与NSP8互作,且NSP8定位于细胞核和细胞质中。本研究通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀实验和间接免疫荧光法筛选及鉴定了LDHB与NSP8存在互作,为理解PEDV与宿主细胞蛋白的相互作用机制奠定基础,为阐明PEDV侵染细胞机制提供科学数据。
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