研究背景肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,是导致死亡的主要原因。小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是支气管肺癌中未分化癌分型,约占全部肺癌的15%。由于较早发生较强的侵袭性和早期发生血行转移及淋巴转移,预后极差。虽然小细胞肺癌患者早期对一线化疗方案(足量EP方案：依托泊式或伊立替康+顺铂/卡铂)敏感,但由于极易出现多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象而导致治疗失败。因此,化疗抗药性机制已成为近年来小细胞肺癌临床治疗急需解决的重要问题之一。目前SCLC耐药机制研究已取得一定进展,研究发现MDR的分子遗传基础是复杂的,涉及多个进程,如药物转运,药物代谢,DNA合成和修复,细胞的存活和凋亡,许多具体的分子机制尚不完全清楚。EphA3属于RTK基因家族中第一大亚群Eph受体家族,编码含983个氨基酸的跨膜蛋白质,在胚胎发育过程中广泛表达,在神经系统和心脏中表达水平最高,在脑、肺、膀胱、前列腺和结肠中表达水平较低。在被确定发生EphA3基因突变的肺癌、结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤等肿瘤,激酶活性或与Ephrin配体结合受损,和/或细胞表面受体分布水平减少。本课题组已将SCLC的多药耐药细胞株NCI-H69AR进行基因芯片检测,其中与母株NCI-H69相比较,NCI-H69AR中EPHA3表达显著降低,且进一步经qRT-PCR和Western Blot证实。结果提示EPHA3可能参与了SCLC耐药性的调控。目前,EphA3在SCLC中的表达以及在SCLC细胞株多药耐药性的作用机制尚未清楚。microRNAs (miRNAs)是近年来在真核生物中发现的一类由18-24个核苷酸组成的非编码RNA。成熟的miRNAs通过靶基因3’UTR的部分序列互补区域来调控靶基因,通过翻译抑制或mRNA降解来调控mRNA蛋白表达。miRNAs在调控细胞发育时期,细胞增殖和细胞凋亡的基因表达中发挥重要作用。由于许多相同的生物过程与癌症化疗敏感性和耐药性相关,因此,miRNAs被认为与药物的敏感性和耐药性有关,而且这一假说在越来越多的癌细胞株中被证实。如有报道称,在肺腺癌中miR-100下调表达,导致P1K-1过表达,且致对多西紫杉醇化疗耐药。利用生物信息学分析,miR-7对EPHA3可能具有靶向调节作用。目前研究表明,miR-7在人胰腺胰岛细胞中高度表达；在多种肿瘤中表达下调,但经转染后,过表达的miR-7通过EGFR/PI3K/Akt靶向通路使肿瘤细胞的生长明显受抑制,或增加对放疗的敏感性,被认为是肿瘤抑制基因。然而,也有报道称,在非小细胞肺癌细胞株CL1-5和A549研究中,EGFR通过Ras/ERK/Myc通路激活miR-7,并且高表达的miR-7抑制其靶基因ERF的表达,从而促进肿瘤的形成。目前,miR-7在SCLC中的表达,与EPHA3之间的相互关系,及在SCLC多药耐药性中的作用及分子机制尚未清楚。本课题的研究目的为探讨miR-7与EPHA3在小细胞肺癌多药耐药中的作用和相互关系,以及对PI3K/BMX/STAT3信号通路的影响,进一步探讨小细胞肺癌耐药的分子机制,为小细胞肺癌耐药的研究提供依据,为解决临床棘手的小细胞肺癌耐药问题提供一种新策略。材料和方法1.临床标本收集收集2004年7月至2013年2月期间于武警广东总队医院(31例)和广州医科大学附属第三医院(13例)的44例小细胞肺癌石蜡包埋标本,标本为小细胞肺癌纤维支气管镜检查及活检组织,经病理学检查确诊为小细胞肺癌,所有组织标本患者均尚未接受放化疗治疗。本研究经武警广东总队医院和广州医科大学附属第三医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。2.细胞培养人小细胞肺癌敏感细胞株NCI-H69和耐药细胞株NCI-H69AR,以及细胞株NCI-H446、NCI-H146和NCI-H1688均购自美国ATCC。分别采用含10%或20%胎牛血清和青链霉素双抗的RPMI1640培养基,在37℃,5%C02、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验。实验前耐药细胞株至少在不含药物的培养基中培养2周。3.细胞转染细胞瞬时转染：采用阳离子脂质体法进行转染miR-7模拟物、抑制剂和阴性对照(miRNA的转染量均为100nmol/L),操作按Lipofectamine2000试剂说明书进行。稳定转染：采用Lipofectamine2000将表达EPHA3的EPHA3-PEX2-EcoRI/BamHI载体和其空载,以及EPHA3shRNA和其空载分别转染入NCI-H69、NCI-H69AR、NCI-H446、NCI-H146和NCI-H1688细胞,通过G418筛选阳性转染子进行扩大培养,获得稳定表达EPHA3和下调表达EPHA3的细胞株。4.Ephrin-A5Fc刺激培养将Ephrin-A5Fc (2ug/ml)加入细胞培养基中,37℃,5%C02,培养20min后,收集细胞做进一步实验。5.总RNA的提取及实时荧光定量PCR细胞总RNA,包括miRNAs,按照试剂说明书,通过RNAiso Plus从细胞中提取。组织总RNA,采用RNeasy FFPE kit(QIAGEN)试剂盒进行提取。取上述RNA进行逆转录和实时荧光定量PCR。逆转录反应参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒说明,PCR反应采用SYBR Preimix Ex TaqTMII试剂盒,在实时定量PCR反应仪上进行。GAPDH和U6snRNA作为内参,选取三次独立实验后得到稳定表达的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。6.Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后8%或10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,蛋白相对表达强度采用Quantity One4.6.2软件进行相对定量。7.CCK8分析细胞对化疗药物的敏感性细胞以5-20×103/孔接种于96孔板中；瞬时或稳定转染培养24小时后加入顺铂(DDP)、足叶乙甙(VP-16)及阿霉素(ADM)3种化疗药物,继续常规培养24h；每孔加新鲜配制的CCK8溶液10ul和1640培养基100u1,37℃、5%C02下继续培养4h后,终止培养。选择450nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,取每4个重复孔的光吸收值(A值)的平均值,计算各种转染细胞在3种化疗药物不同浓度下的相对抑制率；每个药物浓度下细胞的相对抑制率=(空白孔的平均OD值-每个药物浓度的平均OD值)/空白孔的平均OD值。根据各个药物浓度的细胞抑制率,采用SPSS软件,计算药物的半数抑制浓度(IC50)。耐药指数=实验组IC50/对照组IC50。8.流式细胞术采用流式细胞术分析细胞凋亡,细胞经药物处理24小时后,收集细胞,采用Annexin V/PI检测试剂盒,行细胞早期凋亡率检测。9.双荧光素酶活性检测将荧光素酶报告基因载体瞬时转染24h后,将细胞裂解,然后利用G1oMaxTM96Microplate Luminometer发光检测仪分别测定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。共转pRL-SV40质粒作为内对照用来校正转染效率以Firefly luciferase与Renill luciferase活性的比值作为荧光素酶的相对活性,进行不同样品间的比较。10.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,免疫组化的检测结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野,如果细胞浆阳性的肿瘤细胞数≥10%,则认为该样本阳性。然后,按照细胞染色强度和阳性细胞数量进行评分：棕褐色且阳性细胞数量≥50%为3分,棕黄色且阳性细胞数量26-50%为2分,淡黄色且阳性细胞数量10-25%为1分,无着色或阳性细胞数<10%为0分。11.裸鼠成瘤实验将已筛选的分别稳定表达EPHA3-PEX2-EcoRI/BamHI和EPHA3shRNA质粒的SCLC细胞,按1×107/0.1ml/site注入鼠龄30-40天的雄性BALB/C裸小鼠肩背部皮下。观察裸鼠的成瘤性和生长情况,并按公式：V=0.4×ab2,求得肿瘤的近似体积。连续观察3周,以每组动物移植瘤的体积的平均值绘制移植瘤生长曲线。待3周末断颈处死裸鼠,剥离肿瘤,进行检测。12.统计学分析所有结果均经IBM SPSS19.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,实时定量PCR、western blot、凋亡实验、荧光素酶活性测定实验进行方差分析前进行方差齐性检验,方差齐采用one-way ANOVA,方差不齐采用近似F检验Welch法；组间两两比较前均先进行方差齐性检验,方差齐性采用LSD法,方差不齐的多重比较采用Dunnett’s T3法。CCK8采用one-way ANOVA,参数比较前均先进行方差齐性检验,若方差不齐用基于方差不齐的近似F检验Welch法。EPHA3表达与临床病理特征的关系分析采用卡方检验,并进行Kaplan-Meier分析和Cox回归分析。各实验至少独立重复3次,重复性好。所选图为3次重复实验的结果之一。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.EPHA3在小细胞肺癌组织中的表达及临床病理意义1.1EPHA3在男性患者中的阳性表达率为35.1%(13/37),在女性患者中的阳性表达率为57.1%(4/7),两者的EPHA3阳性表达率无统计学差异(X2=1.203,P=0.273)。EPHA3在小于59岁的患者中阳性表达率为42.1%(8/19),在59岁及以上患者中阳性表达率为36%(9/25),两者的EPHA3阳性表达率无统计学差异(X2=0.170,P=0.680)。EPHA3在局限期(LD)患者中的阳性表达率为21.4%(3/14),在广泛期(ED)患者中的阳性表达率为46.7%(14/30),两者的EPHA3阳性表达率无统计学差异(X2=2.564,P=0.109)。 EPHA3在死亡患者中的阳性表达率为31.3%(10/32),在存活患者中的阳性表达率为58.3%(7/12),两者的EPHA3阳性表达率无统计学差异(X2=2.700,P=0.100)。1.2采用Kaplan-Meier法估计患者生存时间,结果发现男性患者与女性患者的生存时间无统计学差异(X2=0.678,P=0.407)；小于59岁的患者与不小于59岁的患者生存时间无统计学差异(X2=2.874,P=0.09)；局限期患者的生存时间长于广泛期患者,具有统计学差异(X2=6.400, P=0.011); EPHA日性患者的生存时间长于阴性患者,具有统计学差异(X2=4.653, P=0.031)。 Cox回归分析患者的性别、年龄、疾病临床分期及EPHA3表达与患者预后的关系,发现疾病临床分期和EPHA3可作为独立的预后因子,广泛期患者的相对危险险度6.323,相对危险度的95%可信区间为2.216-18.042; EPHA3阳性表达的相对危险险度为0.192,相对危险度的95%可信区间为0.072-0.508,差异具有统计学意义(P=0.001,0.001)。2.EPHA3通过PI3K/BMX/STAT3通路参与小细胞肺癌多药耐药性的调节2.1EPHA3在耐药细胞株H69AR中的表达均低于敏感细胞株H69,差异具有统计学意义(P<0.01)。将EPHA3shRNAs和NC转染入H69细胞,下调EPHA3的表达,提取总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR和Western Blot检钡EPHA3mRNA和蛋白的表达,结果提示EPHA3-1690的mRNA和蛋白的表达低于其他各组,因此,选择抑制效果最好的EPHA3-1690进行后续实验。采用同样的方式,分别筛选出对H69AR、H446和H1688细胞株抑制EPHA3表达效果最好的shRNA进行转染。沉默EPHA3表达可显著增力PSCLC细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的耐药性,增加化疗药物作用后细胞的生存率,升高IC50值；H69细胞株早期凋亡率下降,PI3K-p110蛋白表达下调,BMX和pSTAT3蛋白表达上调,降低LY294002和LFM-A13诱导的细胞凋亡。相反通过转染EPHA3-PEX2-EcoRI/BamHI,上调EPHA3的表达,可降低化疗药物作用后SCLC细胞的生存率,降低IC50值,增加细胞对化疗药物的敏感性；H69AR细胞凋亡增加,PI3K-p110蛋白表达上调,BMX和pSTAT3蛋白表达下调,增加LY294002和LFM-A13诱导的细胞凋亡。差异均有统计学意义(P<0.05)。2.2采用裸鼠成瘤模型分析EPHA3对SCLC细胞株致瘤能力的影响,绘制裸鼠成瘤生长曲线。各组经方差齐性检验,方差齐性(P值大于0.05)；采用one-way ANOVA方法分析移植瘤体积,各组差异显著有统计学意义(F=24690.931,P<0.001)。采用Tukey’s Multiple Comparison Test结果发现：在H69细胞株,下调EPHA3的表达,导致细胞成瘤能力显著下降(F=277.5,P<0.05)；相反,对H69AR、H446和H146细胞上调EPHA3的表达,导致细胞成瘤能力显著增加,具有显著统计学意义(F=38.64,76.83,80.03,P均小于0.05)。而对来源于转移瘤的H1688细胞而言,其侵袭转移能力明显强于成瘤能力,上调或下调EPHA3对其成瘤能力的影响尚不显著,差异无显著统计学意义(F=4.416,1.325,P均大于0.05)。其机制需待进一步研究。3.MiR-7通过PI3K/BMX/STAT3通路参与小细胞肺癌多药耐药性的调节3.1利用miRNA靶基因预测软件(PicTar和TarScan)分析发现,miR-7与EPHA33’-UTR具有互补结合位点,提示miR-7对EPHA3可能具有靶向调节作用。3.2为了进一步证实miR-7影响EPHA3的表达,我们分别将miR-7模拟物(angomir)和抑制物(inhibitor)转染至细胞,上调和下调miR-7的表达水平,观察SCLC细胞中EPHA3的表达,结果提示,过表达miR-7可导致SCLC细胞中EPHA3的表达降低,同时增加细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的耐药性,升高IC50值；H69细胞早期凋亡率下降,PI3K-pll0蛋白表达下调,BMX和p-STAT3蛋白表达上调,降低LY294002和LFM-A13诱导的细胞凋亡。抑制miR-7的表达则作用结果相反。结果进一步证实miR-7对EPHA3的靶向调控作用,以及通过PI3K/BMX/STAT3通路参与小细胞肺癌耐药性的调节。4.miR-7和EPHA3具有双向调节作用4.1为了进一步证实miR-7和EPHA3之间的关系,我们将31例SCLC组织(?)EPHA3和miR-7的表达进行Spearman相关分析,结果提示miR-7的表达与EPHA3的表达呈负相关(r=-0.444；P=0.012)。4.2为了进一步验证EPHA3对miR-7具有调控作用,将受Ephrin-A5Fc刺激的H69细胞以及转染EPHA3-PEX2-EcoRI/BamHI细胞的H69AR,H446,H146和H1688以增力EPHA3表达,以及将转染EPHA3shRNA以降低EPHA3表达的5个细胞株经qRT-PCR检测miR-7的表达,结果提示各细胞株上调EPHA3组与NC组和mock组相比,均能抑制miR-7的表达,差异具有统计学意义(P均小于0.05)。而下调EPHA3组与NC组和mock组比较,均能上调miR-7的表达,差异具有统计学意义(P均小于0.05)。4.3为了进一步证实miR-7对EPHA3的调控作用,将psiCHECK-2-EPHA3-3’UTR-R或psiCHECK-2-EPHA3-3’UTR载体与miR-7angomir或miR-7inhibitor共转染H69AR细胞,检钡EPHA3荧光素酶活性,结果提示与NC组和Blank组相比,miR-7angomir组H69AR细胞中EPHA3荧光素酶活性显著降低,而miR-7inhibitor组则显著增加,差异具有显著统计学意义。(P<0.001,<0.001)。结论1.EPHA3在SCLC组织中的表达与SCLC患者的性别.年龄.临床分期.生存状态无显著相关,而与患者的生存时间有显著相关。EPHA3可能作为SCLC独立的预后因子。2.EPHA3在多药耐药细胞株H69AR呈低表达,在敏感细胞株H69中呈高表达。上调EPHA3的表达降低SCLC细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的抵抗,降低IC50值；H69细胞早期凋亡率升高,P13K-p110蛋白表达上调,BMX和pSTAT3蛋白表达下调,增加LY294002和LFM-A13诱导的细胞凋亡。下调EPHA3则出现相反的结果。证实EPHA3通过P13K/BMX/STAT3通路参与小细胞肺癌耐药性的调节。3.下调miR-7的表达能降低SCLC细胞对化疗药物ADM.DDP和VP-16的抵抗,降低IC50值；H69AR细胞早期凋亡率升高,P13K-p110蛋白表达上调,BMX和pSTAT3蛋白表达下调,增加LY294002和LFM-A13诱导的细胞凋亡。上调miR-7则出现相反的结果。证实miR-7能通过PI3K/BMX/STAT3通路参与小细胞肺癌耐药性的调节。4.miR-7和EPHA3在SCLC组织中表达呈负相关,上调或下调miR-7的表达能降低或增加EPHA3的表达,荧光素酶实验进一步证实了miR-7对EPHA3的靶向调控作用,而过表达或沉默EPHA3能降低或增加miR-7的表达,表明两者之间具有双向调控作用。两者通过相互作用参与小细胞肺癌的耐药性调节。