研究背景：急性髓系白血病(AML)是造血系统中髓系原始细胞恶性克隆增殖性疾病,是一组具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤1。AML是最常见的成人急性白血病,近年来其发病率呈升高趋势,尽管传统化疗方案和造血干细胞移植技术在不断地改进,却很难再显著的提高AML疗效及其预后,AML治疗已处于瓶颈阶段。研究表明,AML信号通路相关基因及其转录因子表达的改变与AML发生发展及其预后密切相关,它们能够促进白血病细胞增殖、抑制凋亡及阻断分化等多个环节影响AML发生和发展2。随着细胞遗传学以及分子遗传学研究深入,越来越多与预后相关的基因突变被人们所认知3,目前认为针对相关遗传学改变的靶向治疗联合化疗将是提高AML疗效的主要手段,因此深入研究AML发生发展的分子机制、寻找AML治疗新靶点是目前AML研究的热点3,4。Be111a基因定位在人类染色体2p16.1区,基因全长102kb。 Be111a基因能够编码一种C2H2锌指转录因子,最早作为一个逆转录病毒插入位点(EVi9)在髓系白血病BXH-2小鼠中被人们所发现5。近年来的研究发现Be111a可在包括B淋巴细胞、早期T祖细胞、淋巴系祖细胞以及造血干细胞等造血组织中高表达,并在B淋巴细胞发育增殖中起到重要的作用6,7,有文献报道Be111a还能够负调节胎儿血红蛋白的表达8。Be111a在白血病发生发展中的作用尚未明确,有研究指出,Be111a与白血病的发生发展相关9。肌分化因子家族抑制因子a(inhibitor of MyoD family a, I-mfa)是成肌调节因子转录家族成员MyoD的抑制因子,通常表达与胞浆中,可与其他蛋白的核定位信号相结合,从而阻止蛋白转移,作为一种负性调节蛋白调控不同的信号传导通路10。I-mfa及其蛋白产物参与多种细胞功能调节,其中包括了细胞生存、转录以及信号转导的过程,涉及的信号通路包括了JNK通路、Wnt通路等11。近年来有研究发现,I-mfa蛋白的重要功能区域可能与髓系肿瘤的发生相关12。表皮生长因子受体通路底物8(EPS8),是一个97KDa大小的功能衔接蛋白,是表皮生长因子受体(EGFR)重要的激酶活性底物之一,一些络氨酸激酶可以使其磷酸化而具有活性13。EPS8是一种多功能蛋白,它能够参与并调节多种信号传导通路,与细胞的恶化、肿瘤细胞增殖、转移以及侵袭能力增强具有相关性,具体机制尚未明确14,15。近年来有研究发现,EPS8在一些血液系统恶性肿瘤细胞株中高表达,包括了KG1α、ARH-77等,并提出EPS8可能在早期干细胞水平对恶性肿瘤的分化起到调节作用,有望成为早期干细胞起源恶性血液系统恶性肿瘤的治疗靶点16。难治和复发是导致AML治疗失败的最根本原因,目前学者认为多药耐药(MDR)和微小残留病是导致白血病难治和复发的根源17。人类MRD基因家族中的MDRl基因是导致白血病患者产生多药耐药现象的主要因素18。有研究指出,MDRl在多数诊断为AML患者的白血病细胞中高表达,尤其是治疗失败的白血病患者中。此外,多项国内外大规模临床研究结果表明MDR1高表达与AML治疗失败高度相关,是影响AML预后的不良因素19。Nrf2(nuclear factor-erythroid2-related factor2)是调节氧化应激反应的重要转录因子之一20。在生理状态下,Nrf2与胞质蛋白伴侣分子Keap1结合处于相对抑制状态,在氧化应激作用下,Nrf2可被ROS激活并于Keap1解偶联,相关的靶基因产物可以保护细胞免受氧化应激损伤21。既往研究发现,在多种肿瘤细胞中都存在Nrf2的异常激活,是导致肿瘤耐药的重要因素之一22。此外,近年来的研究发现,在AML细胞核中也存在Nrf2基因的异常激活,导致AML细胞对氧化损伤耐受,进而产生耐药23。研究目的：本研究采用了实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),对110例初治急性髓系白血病患者进行了多基因检测(Bc111a、I-mfa、EPS8、MDR1、Nrf2),初步探讨上述基因在初治急性髓系白血病患者白血病细胞中的表达水平及其临床意义,以期为AML的诊断分型、预后评估提供指导,为AML的靶向治疗提供新靶点和理论依据。研究方法：1、病例2010年6月至2013年12月南方医科大学南方医院血液科收治的110例经骨髓细胞形态学、组织化学染色以及流式细胞免疫分型确诊为初治AML患者,其中男性66例,女性44例；年龄12～77岁,中位年龄32岁。考虑M3患者预后及治疗方案的特殊性,未将该型白血病患者纳入本临床研究。白血病分型诊断参照FAB及WHO制定标准,110例患者中FAB分型为M11例,M249例,M414例,M528例,M61例,未定型17例。2、方法抽取AML或者对照组患者骨髓标本2ml EDTA抗凝,用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心分离单个核细胞,TRIzol试剂溶解标本单个核细胞,提取总RNA,使用实时荧光定量PCR法检测多基因(Bc111a、I-mfa、EPS8、 MDR1、Nrf2)表达情况。为排除RNA浓度对扩增效率的影响,各基因mRNA表达水平采用相对表达量表示,即采用2-ACT值(△Ct=Ct Target-Ct GAPDH;2-△Ct=2Ct GAPDH-Ct Target)来表示各基因的相对表达量,并分析各基因在初治急性髓系白血病患者白血病细胞中的表达水平及其与临床特征、疗效及预后的关系。3、统计患者随访自初次就诊日期开始,至2014年1月20日止,随访时间0.5～4.3个月,中位随访时间为9个月,随访率90%。以110例初治AML患者各基因(Bcllla、I-mfa、EPS8、MDR1、Nrf2)表达量的中位数作为分界点,将患者分为各基因高表达组和低表达组。患者初发时白细胞、血红蛋白、血小板计数及骨髓、外周血原始细胞比例比较采用两独立样本t检验；两组非正态分布计量资料之间比较采用Mann-whitney U检验,>2组计量资料之间分布比较采用Kruskal-wallis检验；率的比较采用X2检验；两变量间相关分析采用Spearman rank correlation test;生存分析采用Kaplan-Meier分析,不同曲线之间的差异采用Log-rank检验。生存时间的多因素分析采用Cox Regression。所有数据统计均采用SPSS13.0统计软件,P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果：研究结果：1、荧光定量PCR法检测110例初治AML患者多基因(Bc111a、I-mfa、EPS8、 MDR1、Nrf2)表达,以各基因表达水平中位数为分界点,将患者分为各基因高表达和低表达组,每组患者各55例。初治AML患者Be111a基因低表达组中位年龄显著低于高表达组患者(32岁vs42岁,P=0.000),余基因(I-mfa、EPS8、MDR1、Nrf2)表达分组患者年龄分布差异无统计学意义。此外,110例初治AML患者中各基因高表达组和低表达组相比,初发时外周血象(WBC、HGB、PLT)、外周血及骨髓白血病细胞比例差异均无统计学意义(P均>0.05)。44例女性及66例男性患者Be111a基因中位表达水平分别为0.035(0.005-0.504)和0.032(0-0.443)；I-mfa基因中位表达水平分别为0.018(0-9.726)和0.013(0-31.476)；EPS8基因中位表达水平为0.022(0.001-11.677)和0.022(0-1.527)；MDRl基因中位表达水平为0.022(0.001-26.715)和0.014(0.001-8.223)；Nrf2基因中位表达水平为0.034(0-42.030)和0.030(0.003-0.948)。统计结果发现,不同性别初治AML患者各基因表达水平差异无统计学意义。急性髓系白血病诊断分型参照FAB及WHO制定标准,统计结果发现各基因表达水平高低在FAB各型分布之间差异无统计学意义(P=0.775、0.169、0.601、0.678、0.385,均>0.05)。110例初治AML患者中106例患者行流式细胞术检测骨髓免疫分析,其中CD34表达阳性患者80例,CD34表达阴性患者28例。比较CD34阳性和CD34阴性两组患者各基因(Bc111a、I-mfa、EPS8、MDR1、Nrf2)表达水平,分析各基因表达水平与患者骨髓白血病细胞免疫分型中CD34表达情况的关系,统计结果发现,不同CD34基因表达组患者哥基因表达水平差异无统计学意义。染色体可评估的85例初治AML患者中,按染色体预后分层分为高危组(11例)、中危组(61例)、低危组(13例),Bcllla、I-mfa、EPS8、Nrf2基因表达水平在不同核型危险分组之间比较无统计学差异(P=0.298、0.078、0.896、0.666)；而MDRl基因表达情况在核型中危组为最高,其次为高危组,低危组表达最低,差异具有统计学差异(P=0.019),进一步两两比较分析结果发现中危组患者MDRl基因表达水平显著高于低危组(P=0.007),余各组MDRl基因表达水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。2、经诱导缓解方案化疗后,110例初治AML患者中80例患者达到完全缓解(Complete remission, CR),患者完全缓解率为72.7%。Bcllla低表达组患者完全缓解率为83.6%(46/55),高表达组患者完全缓解率为61.8%(34/55),Bcllla基因低表达组患者CR率显著高于高表达组(χ2=6.600, P=0.010); I-mfa低表达组患者完全缓解率为81.8%,显著高于高表达组(63.6%)(x2=4.583,P=0.032)；MDRl低表达组患者完全缓解率为81.8%(45/55),高表达组患者完全缓解率为63.6%(35/55),两组患者完全缓解率比较具有统计学差异(x2=4.583,P=0.032)；不同EPS8和Nrf2基因表达水平组患者CR率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。患者随访自初次就诊日期开始,至2014年1月20日止,随访时间0.5～43个月,中位随访时间为9个月,随访率90%。至随访终止,患者总生存率为76.4%。生存分析统计结果发现,Bcllla低表达组患者中位生存时间为377天,高表达组患者中位生存时间为218天,低表达组总生存率较高表达组相比具有统计学差异(83.6%vs69.1%, P=0.009); MDR1低表达组患者中位生存时间为410天,高表达组患者中位生存时间为216天,低表达组患者总生存率较高表达组相比具有统计学差异(81.8%vs70.9%,P=0.045)。此外,余基因(I-mfa、EPS8、 Nrf2)表达水平高低组患者,总生存率差异均无统计学意义(P>0.05)。3、对可能影响急性髓系白血病患者生存预后各项因素,包括患者的年龄、初发时外周血象(白细胞计数、血小板计数、血红蛋白)、初发时外周血和骨髓原始细胞比例、各基因(Bcllla、I-mfa、EPS8、MDRl、Nrf2)表达、CD34表达情况、染色体危险度分层等进行Cox回归模型多因素生存分析,结果发现年龄、初发时外周血白细胞计数以及MDRl基因表达水平是影响AML预后的独立影响因素。研究结论：1、Bcllla基因低表达组患者中位年龄显著低于高表达组,Bcllla高表达患者,CR率、总生存率低,中位生存时间缩短；I-mfa高表达组患者CR率显著低于低表达组,但两组患者总生存率差异无统计学意义；MDR1高表达患者,CR率、总生存率低,中位生存时间缩短。Bc111a、I-mfa、MDRl均可能是初治AML患者预后差的指标之一。2、对初治AML患者来说,不同EPS8及Nrf2基因高表达水平组患者CR率、总生存率差异均无统计学差异。3、Cox回归模型多因素生存分析结果发现,患者年龄、初发时外周血白细胞计数以及MDR1基因表达水平是影响AML预后的独立影响因素。