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背景与目的:缺血性脑卒中是健康领域亟待解决的重要问题之一。脑缺血后神经元死亡是导致脑组织不可逆性损伤的关键节点。因此,阐明神经元死亡的调控通路具有重大的临床转化意义。细胞死亡有多种不同形式,包括坏死、凋亡、自噬及有丝分裂灾难相关死亡等。铁死亡是近年来新发现的、铁介导的、以细胞内大量脂质活性氧(Reactive oxygen species,ROS)累积为特征的新型细胞死亡方式,在缺血性脑损伤后的病理生理过程中起重要作用。抑制铁死亡过程可减轻缺血性脑损伤,但铁死亡如何被启动,又如何被调控,尚待阐明。长寿因子 1(Sirtuin 1,Sirt1)和音猬因子(Sonic Hedgehog,Shh)信号参与调控器官、组织的发育、损伤和修复。激活Sirt1或Shh能发挥强大的神经保护和修复作用,但Sirt1和Shh是否调控脑缺血损伤后铁死亡的发生及发展,尚不清楚。课题组前期研究显示Sirt1可能是Shh信号上游调节剂,Sirt1激动剂白藜芦醇(Resveratrol,Res)可增强Shh信号通路的激活,促进脑缺血损伤后神经发生,减少神经元死亡,并改善神经功能。但Sirt1是否能通过Shh信号调控缺血性脑损伤后铁死亡过程,从而减少缺血组织损伤,亟待阐明。因此,本研究采用体内及体外实验相结合方式探讨Sirt1是否通过Shh信号调控缺血性脑损伤后的铁死亡过程,为早日开发干预缺血性脑损伤后铁死亡过程进而促进神经功能恢复的药物奠定实验基础。实验方法:实验分为体内和体外实验。体内实验以Sprague-dawley(SD)大鼠为研究对象,构建大脑中动脉闭塞-再灌注(Middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R)模型,分别侧脑室或腹腔注射给予DMSO、Ferrostatin-1、Sirt1激动剂白藜芦醇、腺病毒转染过表达Sirt1和Shh或敲除Shh处理。体外实验以SD新生鼠原代皮质神经元为研究对象,构建氧糖剥夺-复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,分别给予 Sirt1 激动剂白藜芦醇、Ferrostatin-1、DMSO、erastin、RSL3、Shh 通路 Smo 受体抑制剂环王巴明处理。采用苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色检测组织结构变化;普鲁士蓝(Perl’s)染色确定铁离子沉积;免疫印迹(Western blotting,WB)检测铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、Ferritin 与酰基辅酶 a 合成酶长链家族成员 4(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)的动态表达;DCFH-DA染色检测组织ROS表达;GSH试剂盒检测组织及细胞中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平;超微电镜观察线粒体改变;2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色(2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride,TTC)染色确定脑梗死体积;尼氏染色检测神经元结构;退行性神经元(Fluoro-Jade C,FJC)染色检测梗死灶内及梗死灶周围发生退行性改变的神经元;免疫荧光检测Sirt1、Shh表达和原代皮质神经元纯度与结构变化;细胞计数试剂盒(Cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞存活率;铁比色法检测细胞内铁离子水平;流式细胞仪确定DCFH-DA荧光检测细胞内ROS水平。实验结果:(1)MCAO/R损伤可诱导SD大鼠缺血脑组织中发生铁死亡相关改变,如蛋白(GPX4、Ferritin和ACSL4)表达改变、结构损伤、铁离子沉积、ROS增加、线粒体空泡化等,并可能在MCAO/R 7d时到达峰值(P<0.05)。(2)应用铁死亡抑制剂Fer-1抑制铁死亡发生,可减少MCAO/R后神经元损伤,降低缺血脑组织的梗死体积(P<0.05)。(3)Sirt1可调控MCAO/R后的铁死亡过程。①MCAO/R损伤后第7d缺血脑组织中Sirt1的表达下调。②Sirt1激动剂白藜芦醇预处理可影响MCAO/R后铁死亡相关蛋白(GPX4、Ferritin和ACSL4)的表达,降低ROS水平及神经元退行性改变,减少缺血脑组织损伤及梗死体积。③过表达Sirt1可明显增加铁死亡保护性蛋白的表达,并抑制铁死亡损伤蛋白表达(P<0.05)。(4)Shh可调控MCAO/R后的铁死亡过程。①MCAO/R损伤可增加梗死灶内Shh表达,即激活Shh信号通路。②过表达Shh,可增加缺血性脑组织中铁死亡保护性蛋白水平而抑制铁死亡损伤蛋白的表达,敲除Shh后则有相反的铁死亡促进效果(P<0.05)。(5)敲除Shh后,Sirt1激动剂白藜芦醇预处理对缺血性卒中后铁死亡相关蛋白的作用受到了明显抑制,仅铁死亡损伤蛋白ACSL4轻度下降,其他铁死亡保护蛋白并无明显增加(P<0.05)。(6)Sirt1对体外原代皮质神经元氧-糖剥夺模型构建后铁死亡的影响。①OGD/R损伤可诱发体外培养的原代神经元发生铁死亡。②Res预处理有铁死亡抑制剂Fer-1相类似的效果,可抑制原代皮质神经元OGD/R后的铁死亡相关损伤,并提高神经元存活率。③Res预处理可抑制铁死亡诱导剂erastin与RSL3诱导的皮质神经元铁死亡相关损伤,提高神经元活力。④Res预处理可减轻因Shh通路抑制而加重的皮质神经元OGD/R损伤后的铁死亡,提高神经元存活率(P<0.05)。结论:Sirt1可能通过Shh通路调控铁死亡过程,减轻缺血脑组织及神经元损伤。