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目的:对kinectin蛋白进行生物信息学分析,同时克隆肝癌相关抗原Kinectin基因片断(2089-2367bp),并进行原核表达和初步纯化,为后续研究奠定基础。方法:(1)利用Vector NTI软件及互联网上蛋白质数据库软件等对人kinectin蛋白序列进行生物信息学分析;(2)提取人肝癌总RNA,逆转录酶合成cDNA,根据GenBank公布的Kinectin基因cDNA序列(登录号Z22551)设计引物,利用RT-PCR法扩增出人Kinectin基因片断(编号1-8a),将基因片断插入原核表达载体pMAL-C2中,将重组质粒pMAL-C2/kinectin1-8a转化DH5a菌,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定及DNA测序筛出正确的重组子,转化大肠杆菌Rosetta进行表达,采用不同的IPTG加入时机及加入浓度、诱导温度、诱导时间对工程菌进行诱导表达,并通过SDS-PAGE电泳鉴定,以找出最适诱导条件,将按优化条件诱导表达的融合蛋白过Amylose-resin亲和层析柱纯化,factor Xa蛋白酶酶切,获得纯化的kinectin1-8a蛋白,送蛋白质串联质谱分析鉴定。结果:(1)人kinectin蛋白生物信息学分析结果表明:①kinectin蛋白分子量约156KD,等电点5.52,N端具有高疏水性,疏水区位于分子的内部;②选择5个哺乳动物类不同物种的kinectin氨基酸序列进行同源性比对,分析表明:人与其他物种的同源性从高到低依次是狐(93.5%)、牛(92.6%)、马(92.5%)、小鼠(83.3%)、褐鼠(64.4%);③kinectin的二级结构以α螺旋为主,有一个跨膜螺旋(第9～29AA),一个跨膜区,此外还存在一个信号肽;④kinectin蛋白序列上具有较多糖基化、磷酸化位点,结构域主要位于2～699, 776～899,923～1319氨基酸位置;⑤存在较多T细胞表位和B细胞表位。(2)目的基因正确插入载体pMAL-C2质粒的多克隆位点,并成功诱导表达出MBP-kinectin1-8a融合蛋白;确定了pMAL-C2/kinectin1-8a体外表达的优化条件:37℃振荡培养3个小时后,加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG,继续在30℃振荡培养4小时,可获得较优表达效果;蛋白质飞行质谱仪分析所得的肽段与目的蛋白相符。结论:(1)利用生物信息学分析软件预测了kinectin蛋白的结构域、功能域及抗原性,显示kinectin具有较强的免疫原性和较多的表位;(2)表位预测1-8a片段存在一个得分较高的T细胞表位,5个B细胞表位;(3)成功构建了含Kinectin基因片断1-8a的原核表达载体,并获得表达和初步纯化。