论文部分内容阅读
[目的]
1.通过流式细胞仪对分离纯化的大鼠骨髓间充质干细胞进行鉴定，为实验提供合格的细胞来源。
2.观察不同浓度小檗碱对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，以评价其能否促进骨髓间充质干细胞成骨分化，并探讨其作用机制。
3.进一步观察不同浓度小檗碱对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)成骨分化的影响，探讨其对前成骨细胞分化的影响。
[方法]
1.运用全骨髓贴壁24h半量换液法分离培养BMSCs；倒置相差显微镜逐日观察原代及传代细胞的生长、增殖及形态特征；取生长状态良好的第四代细胞，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原。
2.实验分为空白组、成骨诱导组(化学诱导法：1×10-8mol·L-1地塞米松+10mmol·L-1β-磷酸甘油+100 mol·L-1抗坏血酸)、阳性药物对照组(1×10-6mol·L-1淫羊藿苷+成骨诱导液)和药物组(1×10-5 mol·L-1小檗碱+成骨诱导组、1×10-6mol·L-1小檗碱+成骨诱导组，1×10-7mol·L-1小檗碱+成骨诱导组)。采用MTT法测定不同浓度小檗碱对BMSCs增殖的影响；采用钙钴法对胞浆中碱性磷酸酶进行染色；采用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性；采用免疫放射法测定培养液中骨钙素水平；采用等离子体-直读光谱仪测定细胞钙化程度，茜素红染色法显示钙结节；采用RT-PCR法检测各药物组骨向分化过程中Runx2基因和DKK1基因的表达，阐释其促BMSCs骨向分化可能的作用机制。
3.实验分为空白组、阳性药物对照组(1×10-6mol·L-1淫羊藿苷组)和药物组(1×10-6mol·L-1小檗碱组)。采用MTT法检测不同浓度干预药物对MC3T3-E1增殖的影响；采用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞裂解液中ALP活性；采用等离子体-直读光谱仪测定检测细胞钙化程度。
[结果]
1.倒置显微镜下观察，传4代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测P4代BMSCs表面标志抗原CD29、CD90表达阳性，阳性率为98％。CD45表达阴性，阴性率为99.2％。
2.小檗碱在1×10-9～1×10-5mol·L-1浓度范围对BMSCs增殖无显著影响。1×10-7和1×10-6 mol·L-1小檗碱能明显提高BMSCs内碱性磷酸酶活性。1×10-7～1×10-5mol·L-1小檗碱能明显促进BMSCs骨钙素合成和分泌。小檗碱在浓度为1×10-6和1×10-5mol·L-1小檗碱可增加BMSCs钙盐沉积量和钙化结节形成。1×10-6 mol·L-1小檗碱可使Runx2 mRNA表达上调和Dkkl mRNA表达下调。
3.小檗碱对MC3T3-E1的增殖无显著影响。1×10-6mol·L-1小檗碱能明显提高MC3T3-E1碱性磷酸酶活性，增加BMSCs钙盐沉积量。
[结论]
1.采用全骨髓贴壁24h半量换液法可获得稳定、均质性良好的鼠BMSCs。
2.小檗碱对BMSCs和MC3T3-E1的增殖无明显影响，可促进两者骨向分化。
3.在BMSCs成骨分化过程中，Runx2基因表达上调和DKK1基因表达下调可能是小檗碱促进其骨向分化的机制之一。