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乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitors,AChEIs)是目前世界上治疗阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)的有效药物。在天然药物中开发寻找适合AD患者能够长久服用、药物毒副作用小等优势的AChEIs受到了科研工作者的广泛关注。骨碎补(Drynariae Rhizome)广泛分布于我国辽宁、山东、江苏等地,作为一种天然药用植物在临床上经常被用作治疗认知功能障碍。基于分光光度计的Ellman’s法是筛选潜在AChEIs最经典的方法,多应用于体外乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制活性的测定。但是,天然药用植物的成分复杂具有不确定性,分光光度法容易产生假阳性或假阴性结果。本课题以(Ultra Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)为基础,建立了体内和体外AChE催化碘化乙酰胆碱(Iodized Acetylcholine,ACh-I)转化为碘化胆碱(Iodized Choline,Ch-I)的高通量检测方法,用于评价骨碎补及其主要成分的AChE抑制作用。1.体外AChE抑制活性筛选方法的构建。本课题利用 UPLC-MS/MS,ACQUITY UPLCTM BEH C18(1.7 μm,50 mm × 2.1 mm)色谱柱,以0.5%乙酸-水和乙腈进行等度洗脱,电喷雾离子源(ESI)结合多重反应监测(MRM)正离子扫描模式,检测AChE反应后产生的Ch-I。并优化了 AChE的用量、底物浓度、反应温度以及反应时间等条件,最终确定了 AChE孵育反应的最佳条件。通过计算半抑制浓度(IC50),体外评价AChE抑制活性。选取阳性对照加兰他敏对建立的体外筛选方法进行检测,IC50为1.26±0.15 μM。2.骨碎补中天然AChE抑制剂的导向分离。运用已建立的AChE活性体外筛选方法对骨碎补乙醇提取物、正丁部位、石油醚部位、水部位进行了抑制活性。通过计算IC50值发现正丁醇部位抑制作用明显,进而从此部位活性导向分离出八种黄酮类化合物,经鉴定为:柚皮素(28 mg),圣草酚(19 mg),山奈酚(24 mg),木犀草素(9 mg),紫云英苷(11 mg),木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(7mg),柚皮苷(51 mg)和新北美圣草苷(68 mg)。它们的 IC50值分别为 3.81±0.21 μM,7.19±0.62 μM,11.09±1.02 μM,17.26±0.23 μM,18.24±2.33 μM,17.13±1.02 μM,26.4±1.17 μM 和 22.49±1.25 μM。从而确定,骨碎补乙醇提取物具有抑制AChE活性,而且其中发挥抑制作用的主要成分为黄酮类成分。3.大鼠体内AChE活性检测方法的构建。实验建立了大鼠血浆和脑组织中内源性AChE活性检测方法。以甜菜碱为内标溶液、盐酸异丙嗪为丁酰胆碱酯酶抑制剂,将稀释后的血浆和脑匀浆与底物ACh-I混合,经过反应后,用UPLC-MS/MS测定反应混合物中的产物Ch-I的量,并计算AChE活性。测试了 6只老年大鼠血浆和脑组织中的AChE活性,结果表明,老年大鼠血浆中AChE活性为0.1394-0.1905 U/mL,脑组织中AChE活性为0.7015-1.0922 U/mL。4.骨碎补总黄酮对老年雌性大鼠血液及脑组织中AChE酶活性的影响。运用已建立的大鼠体内AChE活性测定方法,检测口服给药骨碎补总黄酮部位(总黄酮含量85.83%)后,大鼠血液和脑组织中的AChE活性变化,从而从体内实验角度证实骨碎补中总黄酮的AChE抑制能力。结果表明,正常年龄(8周龄)大鼠组血浆、脑组织匀浆的AChE活力值0.0348±0.002和0.3059±0.003 U/mL;老年大鼠(25周龄)组血浆、脑组织匀浆的AChE活力值0.1459±0.023和0.9078±0.003 U/mL;老年大鼠(25周龄)口服给药骨碎补总黄酮部位30天后,血浆、脑组织匀浆的AChE活力值0.0926±0.012和0.5310±0.002 U/mL。结果表明,与正常大鼠比较,老年组大鼠血浆和脑组织中AChE活力显著增加(P<0.05),给药骨碎补总黄酮后,老年大鼠血浆、脑组织的AChE活力显著降低(P<0.05)。从而确定,骨碎补总黄酮能够显著抑制老年大鼠AChE活性,并从整体动物水平证实了骨碎补中的总黄酮为有效的天然AChE抑制剂。本论文建立了基于UPLC-MS/MS的体内和体外AChE活性测定方法,并确定了骨碎补中抑制AChE的有效成分为柚皮苷等黄酮类成分。不仅为从天然药用植物中寻找和发现AChEIs候选药物提供了新的方向,也为开发治疗AD的药物提供了更多有利的基础条件,未来有很好的开发前景和价值。