【摘 要】
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目的:CRISPR/Cas9作为一种常用的基因编辑技术,已广泛用于哺乳动物细胞的基因编辑研究。然而小鼠原代造血干细胞（HSC）由于数量稀少,难以被携带大片段的外源基因感染,因此在原代HSC水平上进行基因编辑仍然比较困难。本课题主要利用CRISPR/Cas9技术建立了在小鼠原代HSC水平进行基因敲除的方法。方法:首先利用Cas9-EGFP基因敲入小鼠与Cre-ER小鼠杂交产生可诱导表达Cas9蛋白的
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目的:CRISPR/Cas9作为一种常用的基因编辑技术,已广泛用于哺乳动物细胞的基因编辑研究。然而小鼠原代造血干细胞（HSC）由于数量稀少,难以被携带大片段的外源基因感染,因此在原代HSC水平上进行基因编辑仍然比较困难。本课题主要利用CRISPR/Cas9技术建立了在小鼠原代HSC水平进行基因敲除的方法。方法:首先利用Cas9-EGFP基因敲入小鼠与Cre-ER小鼠杂交产生可诱导表达Cas9蛋白的Cas9-EGFP/Cre-ER转基因小鼠模型;利用CHOPCHOP网站设计靶向小鼠Pax5基因的sgRNA序列,以sgScramble作为对照,并构建包含该序列的慢病毒载体并包装病毒;利用流式细胞术分选该小鼠骨髓原代HSC（HSC1:Lin-c-Kit+Sca-1+CD150+CD48-CD201+;HSC2:Lin-c-Kit+Sca-1+CD150-CD48-CD201+）细胞,使用sgPax5-Crimson慢病毒进行体外感染以实现对Pax5基因的敲除,以sgScramble-Crimson作为对照,并对感染后细胞进行流式分析检测感染效率;同时提取感染后细胞的基因组DNA进行Pax5基因的靶向测序以检测基因敲除效率;将感染后细胞移植进入受致死剂量照射的受体小鼠,移植后监测在HSC水平敲除Pax5基因后对造血重建及谱系分化的影响。结果:1)Cas9-EGFP基因敲入小鼠（B6;129）首先与C57BL/6J（CD45.2）回交十代,以获得纯合的CD45.2遗传学背景,之后与Cre-ERT2（CD45.2）小鼠进行交配,根据基因型鉴定结果从子代中筛选获得Cas9fl/-Cre+/-双阳性子代小鼠。2)给予Cas9fl/-Cre+/-小鼠连续五天腹腔注射他莫昔芬诱导Cas9-EGFP的表达:两周后外周血中只有髓系细胞（Mac-1/Gr-1+）能够表达EGFP（20%）;四周后外周血中除成熟红细胞（Ter119+）外,淋系细胞（B:B220+;T:CD3/4/8+）、髓系细胞以及血小板（CD41+）都能够表达一定比例的EGFP（10%-20%）;八周后外周血各谱系细胞EGFP表达稳定,其比例与诱导四周后EGFP比例无统计学差异。3)基于造血干祖细胞单细胞RNA测序及移植结果发现:HSC2（Lin-c-Kit+Sca-1+CD 1 50-CD48-CD201+）为一群具有多谱系分化能力但偏向淋系分化的HSC,在淋系细胞的成熟发育过程中发挥着重要的作用。4)使用sgPax5/sgScramble-Crimson慢病毒对HSC（HSC1以及HSC2进行体外感染72h后检测其感染效率:HSC1的Pax5敲除组和对照组的感染效率分别为69.0%±21.0 vs.74.8%±13.6;HSC2的Pax5敲除组和对照组的感染效率分别为51.9%± 33.2 vs.61.4%± 17.7。5）使用sgPax5/sgScramble-Crimson慢病毒对HSC进行体外感染48h后,再与OP-9小鼠基质细胞共培养7天,分选阳性感染细胞并提取全基因组DNA进行Pax5靶向测序,结果显示CRISPR/Cas9的编辑效率为92%。6)Pax5敲除组外周血中供体来源的细胞总重建率无明显差异:其中髓系细胞与T细胞重建正常,而敲除组受体小鼠外周血中缺失成熟B细胞。HSC1与HSC2组表型相似,无明显差异。7)与对照组相比,Pax5敲除组小鼠骨髓中供体来源的B细胞比例明显升高,其中以pro-B为主（45.3%±15.7 vs.7.0%±12.6,P<0.01）;T淋巴细胞以及髓系细胞比例相对于对照组未有显著变化;造血祖细胞MPP3比例的明显增高（0.49%±8.2 vs.2.8%±25.7,P<0.01）;而HSC比例无显著改变。HSC1与HSC2组无明显差异。结论:1)本方法通过优化HSCs体外培养体系及简化外源性质粒大小,建立了在少量高度纯化的HSCs水平的一种高效且便捷的基因敲除方法。2)基于此方法,本研究成功在小鼠骨髓原代HSC水平敲除Pax5,导致骨髓中出现了 Pro-B的阻滞现象,外周血中成熟B细胞缺失现象,与既往研究结果一致。
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