论文部分内容阅读
白血病是一类复杂的造血干细胞恶性克隆性疾病,不同种类的白血病中基因的突变类型以及异常表达情况各异,而这些常常暗示着不同的治愈情况及预后效果,因此分系分型治疗在白血病治疗中十分必要。急性B淋巴细胞白血病（B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia,B-ALL）起源于B淋巴细胞恶性增生,多发于儿童,大多数患者可以治愈,但仍有少部分因复发而死亡。近年来成人群体,尤其是老年人的B-ALL发病率有所增加,复发和死亡情况较儿童来说更为严重,因此找到新的治疗靶点或治疗方式来改善B-ALL治疗效果及预后显得尤为迫切。Sirt2是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶,可以参与调控细胞周期、增殖、分化以及凋亡等生理过程。已有研究显示,Sirt2在B-ALL癌症患者体内和B-ALL细胞中高表达,并且Sirt2抑制剂可以有效地抑制部分癌细胞生长并诱导细胞凋亡,因此AGK2这个特异性的Sirt2抑制剂成为治疗B-ALL的潜在药物之一。本文目的就在于研究AGK2对B-ALL细胞凋亡的影响及其作用机制,并为其在B-ALL治疗中的应用提供实验依据。在本研究中选取了四种急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM、Jurkat、Loucy、HPBALL,两种急性B淋巴白血病细胞KOPN8、NALM6,以及三种急性髓系白血病细胞MM6、THP-1和MOLM13进行实验。首先我们通过MTT实验发现,KOPN8和NALM6两种B-ALL细胞随着AGK2浓度升高存活率显著下降,并且与其他细胞相比AGK2在这两种细胞中有较低的IC50值。克隆形成实验结果也显示,AGK2会显著地减弱B-ALL细胞的克隆形成能力。结合这两部分结果我们认为B-ALL细胞对AGK2更敏感。为探究B-ALL对AGK2更敏感的原因,我们通过PI细胞染色和Annexin-ⅤFITC/PI双染法检测了AGK2对9种白血病细胞周期以及凋亡的影响。实验发现,AGK2对9种细胞周期的影响不大且同系细胞间无相似性,但是却可以诱导大多数细胞产生凋亡,这一效果在B-ALL中尤为明显。为进一步探究AGK2诱导B-ALL细胞凋亡的分子机制,我们通过AGK2诱导和构建sh Sirt2、Sirt2recovery、Sirt2 OE以及Sirt2H187Y细胞系等手段,使用Western Blot实验检测了细胞中凋亡相关蛋白的表达水平的变化,以及用Co-IP实验验证了B-ALL细胞中内源性蛋白的相互作用。结果发现:1.Sirt2抑制剂AGK2会使B-ALL细胞中组蛋白乙酰化水平升高,p53蛋白水平上调,Bcl-2蛋白水平下调,Cyto-c、Apaf-1、Caspase9/8/3等蛋白水平上调,从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡;2.沉默Sirt2的表达会导致NALM6细胞增殖减慢,克隆形成能力减弱并产生细胞凋亡;3.sh Sirt2 NALM6和Sirt2H187Y NALM6细胞中p53蛋白水平上调,Bcl-2蛋白水平下调,Bax、Cyto-c、Apaf-1、Caspase9/8/3蛋白水平上调;4.Sirt2沉默表达的NALM6细胞中重新表达Sirt2后,Bcl-2下调,p53介导的的细胞凋亡通路被抑制;5.在NALM6和KOPN8细胞中,内源性的p53和Sirt2存在相互作用。最后得出结论:AGK2可以通过抑制Sirt2的去乙酰化酶活性,使p53蛋白水平上调,Bcl-2蛋白水平下调,并直接作用于p53从而激活p53和Bcl-2介导的Bax/Cyto-c/Apaf1/Caspase9/8/3凋亡信号通路,进而诱导B-ALL细胞走向凋亡。