应用表观转录组芯片技术研究mRNA m6A甲基化差异与胃肠间质瘤危险度的相关性

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第一章对751例极低/低危胃肠间质瘤患者的临床特点和预后的探究研究背景与目的:根据国家卫生研究所(NIH)的共识标准(2008年),直径≤5cm,核分裂象计数≤5/50 HPF的胃肠间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors,GIST),被认为是极低/低危的GIST。对于这些患者,复发率和远处转移率极低,手术后辅助伊马替尼治疗是不必要的。他们的治疗方案是观察和定期影像学评估。然而,临床发现了一些复发/转移的极低/低危GIST。这让我们对现有的评估GIST危险因素的标准提出了质疑。这篇文章的目的就是探究极低/低危GIST的临床特征。研究对象和方法:从2012年1月至2018年10月,在我院选择了751名极低/低危的GIST患者。记录和分析这些患者的基本信息、临床病理特征和临床结果。研究结果:大多数GIST(594/751)发生在胃内。经内镜粘膜下剥离术(Endoscopic submucosal dissection,ESD)切除361例,腹腔镜手术切除198例,开放手术切除192例。整体切除率为100%。其中,低危GIST有516例(69%),极低危GIST有235例(31%)。在38(7至94)个月的中位随访中,534例患者发现4例复发和1例远处转移。结论:极低/低危GIST显示出极低的复发和远处转移率。然而,在我们的研究中仍然有4例复发和1例远处转移病例。根据现有的NIH标准来划分间质瘤的危险度有一定的局限性。第二章m6A表观转录组芯片筛选与胃肠道间质瘤危险度相关RNA并应用实时荧光定量PCR技术进行验证的研究背景与目的:根据第一章的研究结论,我们进一步探索是否存在其他影响GIST预后的因素,以寻找其他可靠的指标,来帮助临床医生更准确地判断患者的实际危险情况以更准确地判断患者预后及指导治疗。目前还没有学者从表观遗传学角度探讨影响GIST危险度分级的因素。于是,我们在临床收集有明显差异的高危间质瘤和低危间质瘤组织标本,探讨表观遗传学对GIST危险度差异的影响。重点关注m RNA的m6A甲基化水平(methylation level)和甲基化量(methylation quantity)的差异,进而发现新的GIST的肿瘤标志物,并为GIST的危险度判断提供新的指标。实验方法:收集2015年11月-2019年4月于郑州大学第一附属医院进行手术治疗的GIST患者的肿瘤标本,从中随机抽取5例高危、5例低危间质瘤进行m6A甲基化检测。提取总RNA后,使用特异性抗m6A抗体对总RNA进行免疫沉淀,再使用Arraystar公司的人表观转录组芯片检测样品的m6A甲基化水平和甲基化量。高危间质瘤和低危间质瘤之间m6A RNA甲基化水平和甲基化量的差异,通过设置倍数变化量(Fold Change,FC)与统计显著性(p值)的阈值而进行过滤鉴定。并将所得结果中的差异m6A修饰的m RNA,进行GO功能富集分析以及KEGG通路分析,并分析出与肿瘤相关的m RNA。最后,应用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)技术及免疫印迹法(Western blotting,WB)验证GIST组织中差异表达的m RNA及蛋白。研究结果:1.总RNA质量鉴定结果表明,标本检测显示,总体RNA质量可靠,所有标本的组织都没有发生降解或被杂质污染,可作为微阵列芯片等的实验材料。利用Arraystar公司的Human m RNA&lnc RNA Epitranscriptomic Microarray(8x60K,Arraystar)芯片检测胃肠道间质瘤高危组与低危组样本的m RNA的m6A甲基化水平和甲基化量。结果显示:在甲基化水平方面,共筛选出168个上调m RNA,46个下调m RNA;在甲基化量方面,共筛选出4492个上调m RNA,201个下调m RNA。2.经上述条件筛选后,将所得的m6A甲基化水平和甲基化量上调的m RNA进行进行GO功能富集分析以及KEGG通路分析。结果显示:在甲基化水平方面,GO功能富集分析的结果主要富集在Wnt信号通路的正调控,基因表达的正调控,细胞表面,细胞外间质,蛋白结合以及肝素结合等细胞功能或结构上;KEGG通路分析结果主要富集在PI3K-Akt信号通路,Rap1信号通路等通路上。在甲基化量方面,GO功能富集分析的结果主要富集在细胞分裂,细胞增殖,细胞质,细胞核,ATP结合以及Actin结合等细胞功能或结构上;KEGG通路分析结果主要富集在PI3K-Akt信号通路,Focal adhesion信号通路等通路上。其中,PI3K-Akt信号通路无论在甲基化水平方面还是在甲基化量方面,都是KEGG通路分析中参与基因最多且最为显著的通路,且VEGFA、INSR和FN1等分子多次参与在这些通路中。3.q RT-PCR证实:高危间质瘤VEGFA、INSR和FN1的m RNA相对表达水平均高于低危间质瘤(p<0.05)。此外,我们通过WB实验,在蛋白水平也验证了上述结论。结论:1.PI3K-AKT通路相关分子的差异甲基化修饰,很可能是影响间质瘤危险度的因素2.高危间质瘤VEGFA、INSR和FN1等m RNA的m6A甲基化修饰程度较低危间质瘤高。3.VEGFA、INSR和FN1这三个m RNA表达水平增高可能与间质瘤的危险度评级较高有关。4.VEGFA、INSR和FN1这三种m RNA及蛋白表达水平增高可能是由于m6A甲基化水平增高引起的。
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