脉络膜黑色素瘤（Choroidal Melanoma）是恶性黑色素瘤的第二常见形式,也是眼内最常见的恶性肿瘤类型,约占葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma）的70%。目前,脉络膜黑色素瘤的治疗主要以放疗和手术切除为主,或二者结合治疗。恶性黑色素瘤的死亡率高达50%,这主要是因为它的潜伏期很长,而且有转移到肝脏（90%）、肺（24%）、和骨（16%）等的重要器官的倾向。临床研究显示,转移性的脉络膜黑色素瘤患者的生存时间中位值小于1年。影响脉络膜黑色素瘤患者预后的因素主要包括肿瘤大小、发病年龄、家族史及药物治疗史等,但最关键的因素是患者诊断时的肿瘤进展情况。因此,必须更好地了解控制脉络膜黑色素瘤发病和进展的分子机制,以便为有需要的患者制定更有效的治疗策略。肿瘤的发生和发展是一个非常复杂的过程,肿瘤细胞不断地经历自身表观遗传学变化以达到其存活并不断增殖以及侵袭转移的目的。例如,一些实体癌细胞能够脱离原位逃逸到体循环。在侵袭和转移的过程中,它们失去了上皮细胞的特性,而获得了间质细胞的特性,因而使其获得了更便于移动的形态。这个过程被称为上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）。相关研究证实,EMT在多种恶性肿瘤的发生、侵袭和转移中都发挥重要作用,因此,研究其发生和发展调控的分子机制,对于发现脉络膜黑色素瘤新的治疗方法有重要的意义。EMT的发生和发展受到EMT激活转录因子（EMT activating transcription factors）的严密调控,包括Snail,Slug,Twistl,ZEB1等。研究表明,这些EMT激活转录因子非常不稳定,它们的蛋白水平受到泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system,UPS）的严密控制。UPS作为真核细胞内重要的蛋白质质控系统,与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,因此对其机制的探讨将为研究恶性肿瘤的发病机制和治疗方法提供新的思路。泛素化降解的过程涉及到Ub（ubiquitin,泛素小分子）,E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）,E3（泛素连接酶）和26S蛋白酶体的一系列反应,其中E3连接酶的功能是特异性识别底物蛋白,因此E3连接酶是UPS中最重要的组成成分。在本课题中我们提出,E3连接酶TRIP的高表达可明显下调脉络膜黑色素瘤细胞的生长和转移能力,且能够明显抑制EMT进程。同时,TRIP可直接与EMT激活转录因子Twistl结合,促进其K48偶联的泛素化,并介导其降解。因此我们提出,TRIP作为一个新的EMT调控因子,可通过介导Twistl的泛素化降解来抑制脉络膜黑色素瘤细胞的EMT进程,从而抑制其增殖和转移。研究目的:1、明确TRIP对脉络膜黑色素瘤细胞增殖和转移的作用;2、探讨TRIP在脉络膜黑色素瘤细胞上皮间质转化进程中的功能;3、研究TRIP的作用靶点及具体分子机制。研究方法:1、通过提取TCGA数据库中的数据分析TRIP表达高低与脉络膜黑色素瘤患者总生存率及转移与否的关系检索并分析人类基因组数据库（TCGA）的RNA-Seq数据。将75例葡萄膜黑色素瘤患者组织中TRIP与内参的差值△Ct与cut off值5.5315相比,△Ct<5.5315呈低表达,△Ct≥5.5315呈高表达。低表达和高表达者分别为24例和51例。生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用Log-rank法,p<0.05为差异有统计学意义。用Student t test分析高侵袭的葡萄膜黑色素瘤类型M3和低侵袭的葡萄膜黑色素瘤类型D3中TRIP的表达差异。2、TRIP对脉络膜黑色素瘤细胞生长和转移的作用2.1 TRIP干扰在脉络膜黑色素瘤细胞增殖和转移中的作用设计TRIP的特异性小干扰RNA,分别把对照siRNA和TRIP siRNA转染入M619 或 OCM-1 细胞,48h 后,①Western blot检测TRIP表达情况,确定干扰效率;②利用MTT法检测TRIP干扰在脉络膜黑色素瘤细胞生长中的作用;③通过Transwell实验检测TRIP干扰在脉络膜黑色素瘤细胞浸润及转移中的作用。2.2 TRIP高表达在脉络膜黑色素瘤细胞增殖和转移中的作用分别将空白载体和TRIP高表达质粒转染入M619或OCM-1细胞,24h后,①Western blot检测TRIP表达情况;②利用MTT法检测TRIP高表达在脉络膜黑色素瘤细胞增殖中的作用;③通过Transwell实验检测TRIP高表达在脉络膜黑色素瘤细胞浸润及转移中的作用。3、TRIP在脉络膜黑色素瘤细胞EMT进程中的作用3.1 TRIP干扰在脉络膜黑色素瘤细胞EMT进程中的作用分别将对照siRNA和TRIP siRNA转染入M619或OCM-1细胞,48h后,RT-PCR 及 Western blot 分别检测 EMT 相关分子标记 E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin mRNA及蛋白水平的表达情况。3.2 TRIP高表达在脉络膜黑色素瘤细胞EMT进程中的作用分别将空白载体和TRIP高表达质粒转染入M619或OCM-1细胞,24h后,RT-PCR 及 Western blot 分别检测 EMT 相关分子标记 E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin mRNA及蛋白水平的表达情况。4、TRIP调控脉络膜黑色素瘤细胞EMT进程的分子机制4.1 TRIP对EMT相关转录因子表达的影响在M619细胞中高表达或干扰TRIP后,Western blot检测EMT相关转录因子（Snail、Slug、ZEB1、Twist1）的表达水平。4.2 TRIP与EMT相关转录因子的结合情况4.2.1在HEK293T细胞中分别共转染带有不同标签的TRIP质粒和Snail、Slug、ZEB1、Twistl质粒,co-IP结合Western blot实验检测TRIP与这些蛋白的结合情况,寻找作用靶点。4.2.2在M619细胞中检测内源性的TRIP与以上实验找到的靶分子的结合情况,进一步验证其作用靶点。4.2.3在HEK293T细胞中分别共转染带有不同标签的TRIP WT质粒、活性区域缺失的TRIP △C51质粒及其靶分子质粒,co-IP结合Western blot实验明确TRIP与其作用靶点的结合位点。4.3 TRIP对其靶分子泛素化的影响4.3.1将带有不同标签TRIP、靶分子及泛素质粒共转染入HEK293T细胞,co-IP结合Western blot实验检测TRIP对其作用靶分子蛋白泛素化的影响。4.3.2在M619细胞中干扰TRIP,检测TRIP对其靶分子泛素化的影响。4.3.3将E3连接酶活性位点（5个半胱氨酸）突变的TRIP CA质粒及靶分子质粒共转染入HEK293T细胞,co-IP结合Western blot实验检测其对靶分子泛素化的影响。4.3.4将带有不同标签的TRIP质粒、靶分子质粒及泛素野生型、K48或K63泛素质粒分别共转染入HEK293T细胞,co-IP结合Western blot实验明确TRIP调控靶蛋白泛素化的具体形式。4.3.5在M619细胞中干扰TRIP,进一步确定TRIP调控靶分子泛素化的具体形式。4.4 TRIP的E3连接酶活性位点缺失对其生物学功能的影响分别将TRIP WT、TRIP C5A及TRIP △C51质粒和空白载体转染入M619细胞,24h后,①利用MTT法检测各个突变体质粒在脉络膜黑色素瘤细胞增殖中的作用;②通过Transwell实验检测各突变体质粒在脉络膜黑色素瘤细胞浸润及转移中的作用。研究结果:1、TRIP的低表达与葡萄膜黑色素瘤的不良预后相关。我们首先检索了人类基因组数据库（TCGA）中的RNA-Seq数据,发现在75个葡萄膜黑色素瘤患者中,TRIP高表达的脉络膜黑色素瘤患者表现出较好的总生存率（OS）（p<0.0001）。另外,在高侵袭的葡萄膜黑色素瘤类型M3中TRIP的表达低于低侵袭的葡萄膜黑色素瘤类型D3。2、TRIP下调脉络膜黑色素瘤细胞的生长和转移能力MTT及Transwell结果显示,干扰TRIP可明显增强M619和OCM-1细胞的生长和转移水平;相反,TRIP高表达可明显下调M619和OCM-1细胞的生长和转移水平。3、TRIP抑制脉络膜黑色素瘤细胞的EMT进程RT-PCR及Western blot结果表明,TRIP高表达可增强M619和OCM-1细胞中E-cadherin的表达,降低N-cadherin、Vimentin的表达;干扰TRIP可降低M619和OCM-1细胞中E-cadherin的表达,增强N-cadherin、Vimentin的表达。4、TRIP靶向作用于Twist13.1 Western blot结果显示,TRIP可特异性负调Twist1蛋白水平的表达,而对其它EMT激活转录因子（Snail、Slug、ZEB1）的表达影响不大。3.2 co-IP结果显示,TRIP可与Twist1直接结合,与其它EMT激活转录因子不结合。5、TRIP促进Twist1 K48位的泛素化,从而介导其蛋白酶体途径的降解4.1 Western blot结果表明,TRIP对于Twist1的降解作用依赖其E3连接酶活性。4.2 co-IP结果表明,TRIP通过其N-末端RING结构域与Twist1结合。4.3外源及内源性泛素化实验结果证实,TRIP可促进Twist1 K48位的泛素化,而对K63位的泛素化影响不大。6、TRIP抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖和转移的功能依赖其E3连接酶活性通过点突变或缺失突变将TRIP的E3连接酶活性位点突变或敲除后,TRIP对脉络膜黑色素瘤细胞增殖和转移的影响消失。结论:1、TRIP的低表达与葡萄膜黑色素瘤的不良预后相关2、TRIP下调脉络膜黑色素瘤细胞的生长和转移能力3、TRIP抑制脉络膜黑色素瘤细胞的EMT进程4、TRIP靶向作用于Twist1,促进其K48偶联的泛素化,并介导其降解5、TRIP抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖和转移的功能依赖其E3连接酶活性创新点及意义:1、利用细胞功能学实验证实了 E3连接酶TRIP可显著下调脉络膜黑色素瘤细胞的生长和转移能力,并抑制其EMT水平;提出TRIP可抑制转录因子Twist1的表达,而对于其它EMT相关转录因子的表达影响不大。这些结果目前在国内外学术杂志上尚未见报道。2、本研究首次证实了 TRIP在脉络膜黑色素瘤增殖和迁移中的调控作用并阐明了分子机制。首次提出并证明TRIP可通过其E3连接酶活性来调控肿瘤的发生和发展,为寻找基因转染防治相关恶性肿瘤的免疫调节疗法提供新途径;研究了TRIP的重要功能域,为设计合成以TRIP为干预靶点的抗肿瘤药物提供了理论依据。