研究背景中耳炎（Otitis media,OM）作为耳鼻喉的常见疾病,其发病率较高,病诊量较大,尤以儿童常见。国内没有确切的OM发病率报道。据欧洲和美国等报道,3岁之前大约80%的儿童经历过至少1次OM。OM最常见的病原菌是肺炎链球菌,肺炎链球菌可引起30%～60%的OM。对于目前急性中耳炎的治疗,临床棘手问题是OM频繁发作,导致的中耳一系列并发症,例如引起患儿鼓室硬化、中耳黏连以及并发中耳胆脂瘤,可导致病患不同程度的听力障碍,严重者会影响到语言的发育。迄今为止,肺炎球菌引发的疾病（Pneumococcal disease,PD）是全世界未被解决的临床卫生医疗问题之一。肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,Spn）导致的OM,现今被认为属于非侵袭性疾病,不早期治疗或治疗方式不当可引发婴幼儿性听力下降,还会导致语言发育中枢滞后,可能累及其他中枢,对儿童损害较大。临床上中耳炎的治疗包括药物和手术,药物以抗生素为主,但由于其耐药性,Spn对常用抗生素应用时间存在限制,使得临床药物治疗难度上升。所以建立合适的模型,同时对OM发病机制和潜在治疗模式探索已成为儿科和耳鼻喉科临床医生的当务之急,我们迫切需要对OM发病机制进行深入研究,寻求治疗靶点。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）作为一种细胞内复杂的膜网络,它不仅可以确保细胞钙和脂质的稳态,还可以有效介导蛋白的的折叠和运输,尤其是跨膜、分泌蛋白的途径。ER是一种多功能细胞器,包含着许多酶,折叠酶和伴侣蛋白,可协助氧化蛋白折叠和其他翻译后修饰可确保维持ER稳态。在组织缺氧、细胞应激及感染造成的稳态失衡这些生理和病理条件下可引发内质网蛋白质功能受到抑制,促使UPR（未折叠蛋白反应）,引起内质网应激ERS（ER-stress）。ERS的特征是活化转录因子4（ATF4）-C/EBP同源蛋白（CHOP）的激活途径。越来越多的证据表明,ERS参与多系统多器官疾病的发生、发展,如脑血管/心血管系统疾病、神经样病变、病毒性炎症、听功能损伤等,在这些人类疾病的发病机理中起着不可忽视的作用。研究发现,炎症会触发内质网应激,使内质网内环境失衡,导致炎症性疾病发生。最近,在各种炎症性疾病研究中,一些研究已经报道了内质网应激和炎症反应之间的信号串连作用,特别是炎症性肠病中两者关系密切相关。而且,众所周知,内质网中蛋白质的过度生产可以引发炎症,炎症反应可以触发内质网应激。先前的研究认为,炎症发生可以激活UPR,诱发内质网应激启动,破坏内质网稳态平衡,从而导致炎症性疾病。除了内质网应激和炎症之间相互作用的复杂性外,细胞对内质网应激的反应有特定细胞类型的成分,这些成分决定了对应激条件的适应或适应不良和死亡。在内质网应激的一系列反应中,可激活炎症基因表达程序,调节炎症基因表达。事实上,我们已经表明,在环境应激强度增加的过程中,通过eIF2a激酶PKR的一个新的轴与蛋白质PACT相互作用,过度激活促炎症反应的发生。据先前研究报道,ERS过程中PACT-PKR的激活机制是促凋亡的,同时可诱发细胞炎症程序。根据以往的文献数据认为,内质网应激与促炎条件相互作用,互为因果。但是,在OM发病机理中,内质网应激的作用机制尚不明确。因此,我们在一个实验性的OM小鼠模型中测试了内质网应激和炎症基因表达的存在,同时探讨运用内质网应激的抑制剂如何影响促炎反应和OM的发病机制。更进一步研究OM及ERS的关系,对于研究炎症发生理论和完善细胞自修复机制具有重要意义,且有助于进一步认识疾病发生发展的机制,为临床OM疾病预防提供新理论依据,对OM治疗提供新药物途径。拟解决的科学问题1)如何构建利于中耳炎长期效应观察类似人类中耳炎的模型,该模型是否适于讨论中耳炎分子机制及过程?2)构建的OM模型是否有内质网应激反应的启动,内质网应激又是否反作用于OM?3)抑制内质网应激是否可以减低炎症反应,降低OM发生?4)内质网应激在OM是否起到关键作用或者主导作用?第一章:构建合适的OM模型:肽聚糖（PGPS）诱导的B6小鼠中耳炎模型特点研究方案:我们先前的研究中证明,接种格兰仕阳性杆菌细胞壁成分肽聚糖(PGPS可诱导中耳炎症反应,从而创建不需要活细菌或病毒的OM模型,该模型生存率高利于长期效应观察。PGPS是一种病原体相关微生物模式（PAMP）可以激活Toll样受体2（TLR2）,导致免疫反应的激活。本文采取鼓室内注射肽聚糖（PGPS）（PGPS最佳注射剂量为55μg/10μL,PBS为溶剂）诱导C57BL/6J（B6）小鼠,构建中耳炎（OM）模型,PBS（10 μL）构建对照组。通过耳内窥镜形态学观察,听觉脑干诱发电位（ABR）、畸变产物耳声发射技术（DPOAE）及鼓室计功能学观察评估鼓膜形态变化、听力水平及鼓室压力,评判中耳炎模型中耳腔炎症的特点,同时应用HE染色、RT-PCR、Western-blot、TUNEL染色及免疫组化等分子生物学技术检测炎性相关因子及凋亡相关基因的表达,检测PGPS诱导的中耳炎模型的生物学特点。研究结果:1.PGPS诱导后发现第1d小鼠部分外耳道皮肤及鼓膜开始充血,第2d鼓膜标志不清,锤骨纹模糊,第3d鼓室内可见少许脓性分泌物,炎症模型建立。HE染色发现PGPS组小鼠中耳粘膜上皮增厚,中耳腔内炎症细胞增多,以多核细胞为主,对照PBS组中耳腔无炎症细胞浸润。2.听功能学结果提示B6小鼠在PGPS诱导后,Click、8Khz、16kh阈值在ABR上升高有统计学意义;鼓室压力降低,成负压状态。DPOAE测定与PBS组无明显统计学差异。3.PGPS诱导后B6小鼠炎症及凋亡基因cleaved Cas3、TNF-α、IL-6、TLR2mRNA增高,而IL-1β没有差异。Western-Blot也验证了 RT-PCR的结果,提示相应的炎症及凋亡蛋白表达也升高,且有统计学意义。4.免疫组化提示PGPS组中耳粘膜上皮中TNF-α表达阳性,定量分析提示PGPS组表达明显升高,差异有统计学意义。5.细胞凋亡原位检测TUNEL法检测中耳腔组织阳性凋亡情况,PGPS组较PBS组TUNEL阳性中耳表皮细胞数量显著增加,提示在PGPS诱导后的小鼠中耳组织中上皮细胞凋亡增加。第二章 内质网应激与中耳炎的关系研究方案:分组及注射同第一部分,通过RT-PCR和Western-blot探讨PGPS诱导的B6小鼠中耳粘膜上皮组织中内质网相关基因ATF6、Cas12、BIP、CHOP mRNA水平及相关蛋白的表达,探讨内质网应激在中耳炎发生过程中的作用,利用免疫组织化学方法检测凋亡相关蛋白CHOP的表达,探索ERS可诱发细胞凋亡,参与中耳炎的炎症机制;用CellRox试剂盒检测中耳粘膜上皮中ROS的生成,初步探讨氧自由基的生成与中耳炎发生的关系。研究结果:1.取PBS组和PGPS组的B6小鼠中耳组织,运用RT-PCR检测内质网应激相关相关基因ATF6、Cas12、CHOP、BIPmRNA的表达,在PGPS诱导组表达明显高于PBS组,均有统计学意义（P<0.05）。2.运用Western-Blot蛋白免疫检测发现,PGPS诱导组ERS的相关蛋白ATF6、Cas12、CHOP、BIP表达也明显增高,与PBS组比较数值有统计学意义（P<0.05）。3.免疫组化检测凋亡蛋白CHOP,提示PGPS诱导的B6小鼠组CHOP蛋白在细胞质核均有表达;同时运用ImageJ定量分析结果显示PGPS诱导的小鼠CHOP表达明显高于PBS组小鼠,数值有统计学意义（P<0.05）。4.CellRox试剂盒检测中耳上皮组织中ROS的生成,提示PGPS诱导后B6小鼠组比对照PBS组ROS生成明显增多,中耳粘膜上皮细胞荧光染色阳性。第三章 内质网应激抑制剂TUDCA对中耳炎的保护作用研究方案:我们选取B6小鼠随机分为三组:PGPS组（PGPS剂量为55 μg/10μL）,TUDCA治疗组（200μg TUDCA用10μLPGPS新鲜稀释）和PBS组。通过HE染色和耳内窥镜检查,观察三组小鼠中耳腔情况;听觉诱发脑干反应（ABR）检测ABR阈值;WB检测相关炎症及内质网应激相关蛋白表达。研究结果:1.TUDCA组ABR检查在短声Click、低频8KHz、稍高频16KHz明显比PGPS组阈值降低,数值有明显差异（P<0.05）。TUDCA组ABR与PBS组比较,虽然阈值高于PBS组,但统计学无明显差异。2.HE染色显示TUDCA组中耳上皮与PGPS组比较,中耳粘膜上皮增厚减低,炎症细胞浸润减少等,分析中耳粘膜上皮厚度及炎症覆盖面积比值,提示与PGPS组比较TUDCA组中耳上皮炎症减弱,同时测量中耳上皮的厚度以及炎症覆盖面积比值提示,TUDCA组两者数值均降低,数值有统计学意义（P<0.05）。3.westernb-blot提示TUDCA组与PGPS组相比内质网应激相关蛋白ATF6、Cas12、CHOP、BIP mRNA表达明显降低。TUDCA组炎症相关基因TNF-α的表达也明显降低。第四章探讨内质网应激在OM炎症中的主导作用—自噬、氧化应激与中耳炎的作用关系研究方案:随机选取B6小鼠,构建TUDCA、雷帕霉素（Rapamycin RAP）,自噬基因用RT-PCR定量分析,检测PGPS组和PBS小鼠组P62、LC3的表达,探讨TUDCA与RAP对自噬机制的抑制,同时检测内质网应激相关基因在各组的表达,探讨RAP对ER-stress的抑制;RT-PCR检测PBS,PGPS组和TUDCA氧化应激相关基因的表达,探讨氧化应激在PGPS诱导的OM作用;进一步阐明自噬、氧化应激与内质网应激在中耳炎机制中的作用关系。研究结果:1.PGPS诱导的B6小鼠自噬相关基因P62、LC3表达升高,TUDCA及自噬抑制剂Rap治疗后自噬相关基因P62、LC3都明显减低,与诱导组比较数值有统计学意义（P<0.05）;TUDCA组与Rap组相比自噬相关基因P62、LC3表达降低的更明显,而且两组差异有明显不同（P<0.05）,提示TUDCA可通过抑制内质网应激减低OM自噬发生。2.与第三部分结果一致,TUDCA组较PGPS组,内质网应激相关基因ATF6、BIP、CHOP mRNA减低明显,TUDCA组与PGPS组间数值差异有统计学意义（P<0.05）;Rap治疗后较PGPS组内质网应激相关基因ATF6、BIP、CHOP mRNA趋势减低,但两组间数值差异明显（P>0.05）;TUDCA治疗组相对’Rap治疗组内质网应激相关基因ATF6、BIP mRNA减低明显,两组间数值差异有意义（P<0.05）,而CHOP mRNA的减低两组之间无差异,表明Rap不能抑制内质网应激发生。4.氧化应激相关基因检测,PGPS组较PBS组氧化应激相关蛋白SOD mRNA表达轻度升高外,Nrf2、GSH-Px、NOD、Catalase基因mRNA表达无差异;TUDCA治疗后氧化应激相关基因未见明显减低,提示氧化应激机制可能未参与ROS的生成,表明PGPS诱导OM氧化应激没有发生。研究创新性及意义1.成功运用革兰氏阳性杆菌细胞壁成分肽聚糖PGPS在C57BL/6J小鼠诱导中耳炎模型,且该模型较稳定,较以往细菌诱导的模型小鼠生存率高,有助于观察小鼠的中耳炎长期效应。2.内质网应激ER-Stress参与许多炎症的发生与发展。本实验阐述ER-Stress在中耳炎发生发展中的作用及角色,同时探索中耳炎ER-Stress的发生机制;同时抑制ER-Stress可以有效减轻中耳炎症,说明抑制ER-Stress可作为一个治疗OM的潜在靶点,为以后治疗中耳炎提供新的理论基础。3.本论文首次探讨内质网应激在中耳炎中的主导作用,相比自噬及氧化应激,在PGPS诱导的C57BL/6J小鼠中耳炎模型中,内质网应激先于自噬发生,且能激活氧化应激氧自由基的产生,抑制内质网应激同时可以有效抑制自噬的发生,这为OM治疗提供治疗前景。